張 宇 李明明 馬民玉

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院疼痛科，鄭州 450052）

腰椎間盤突出癥是一種臨床常見病和多發(fā)病，以30～55歲的青壯年多見，且其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。由于其病程長，反復(fù)發(fā)作，發(fā)作時引起劇烈的神經(jīng)源性疼痛及痛覺過敏伴活動受限，嚴(yán)重影響病人的健康和生活質(zhì)量[1,2]。

神經(jīng)妥樂平(NTP)是從接種牛痘病毒疫苗的家兔組織中提取而成的一種非蛋白小分子生物活性物質(zhì)，可通過抑制大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元P物質(zhì)的釋放及抑制激肽釋放酶的合成而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效果[3]。體外研究發(fā)現(xiàn)，NTP可降低人椎間盤細(xì)胞COX-2和TNF-α的表達(dá)[4]，提示它可以調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞的功能，減少炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，抑制過度的炎癥反應(yīng)，減輕神經(jīng)根的炎癥損傷而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。

目前國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)多集中探討神經(jīng)妥樂平對神經(jīng)病理性疼痛的整體作用，尚未見有關(guān)神經(jīng)妥樂平對腰椎間盤突出抗炎作用的行為學(xué)及分子學(xué)機(jī)制方面的報道。因此，本實驗建立大鼠腰椎間盤突出模型，觀察其對腰椎間盤突出大鼠的鎮(zhèn)痛作用及對脊髓背根神經(jīng)節(jié)炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)的影響，進(jìn)一步為神經(jīng)妥樂平在腰椎間盤突出癥的臨床用藥方面提供更加精確的理論依據(jù)。

方 法

1.實驗動物及分組

選用健康成年雄性清潔級的SD大鼠15只，體重220～250 g，由河南省實驗動物中心提供[許可證號：SYXK（豫）2011-0001]。實驗動物均分籠飼養(yǎng)，室溫保持22±2℃，相對濕度50%～60%，12 h～12 h晝夜循環(huán)照明；大鼠自由進(jìn)食和飲水。實驗前使大鼠適應(yīng)環(huán)境一周。本實驗經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實驗倫理委員會的批準(zhǔn)，所有操作均遵守國際疼痛研究會相關(guān)指南及《實驗動物使用規(guī)范》，所有動物實驗符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將其隨機(jī)分為3組(n= 5)：實驗組（LDH + NTP 組）、假手術(shù)組（Sham組）及對照組（LDH + Saline組）。

2.實驗?zāi)Ｐ椭苽浼胺椒?/h3>

（1）鞘內(nèi)置管

采用改良Yaksh法[4]行大鼠鞘內(nèi)置管：腹腔注射10%水合氯醛300～350 mg/kg麻醉，待鉗夾大鼠肢體無反應(yīng)后即可準(zhǔn)備手術(shù)。常規(guī)備皮、消毒，以兩側(cè)髂棘為骨性標(biāo)志，其連線為L6棘突，向上三個間隙即為L3-L4棘間，此為手術(shù)切口中心。以此為中心，在腰部作一長約1～1.5 cm的縱向切口，依次切開皮膚及皮下筋膜，暴露肌層。持止血鉗上提L3棘突，以利于暴露椎間隙，用23G針針頭刺破L3-L4棘間硬脊膜，并向頭端置入PE-10導(dǎo)管至脊髓腰膨大處，置管深度約3 cm，如有清亮的腦脊液留出、出現(xiàn)甩尾或抖動反射表明置管成功。在導(dǎo)管置入端打結(jié)，并用1號絲線將其固定于皮下筋膜上，用25G硬膜外穿刺針經(jīng)皮下隧道將導(dǎo)管妥善固定在大鼠頸部，外露約2～3 cm，以便于給藥。用止血鉗夾閉導(dǎo)管遠(yuǎn)端，防止腦脊液外流。用生理鹽水沖洗傷口，傷口撒青霉素粉4萬U，最后依次縫合各層，碘伏消毒后將大鼠置于溫暖、安靜、干凈、避強(qiáng)光的環(huán)境中分籠飼養(yǎng)。術(shù)后注意預(yù)防感染。術(shù)后一天向管內(nèi)注射 10 μl的2%利多卡因，如果大鼠后肢出現(xiàn)運動功能障礙，證明置管成功。取材時若出現(xiàn)導(dǎo)管置入位置不準(zhǔn)確者將不納入實驗中。

（2）建立腰椎間盤突出(LDH)模型神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型

參照Shu-Xun H等[5]建立的通過大鼠自體髓核移植制備大鼠LDH模型的方法：腹腔注射10%水合氯醛300～350 mg/kg麻醉，待鉗夾大鼠肢體無反應(yīng)后即可準(zhǔn)備手術(shù)。備皮、消毒，以L5棘突為中心，于背部作一縱形切口，所有手術(shù)操作均在左側(cè)進(jìn)行。切開皮膚、皮下組織及肌筋膜，分離棘突旁的肌肉，暴露橫突，咬除左側(cè)L4-5椎板、L5關(guān)節(jié)突，暴露L5神經(jīng)根及DRG。橡皮筋結(jié)扎鼠尾根部，于鼠尾根部距肛門1 cm處作一縱形切口，切開皮膚、皮下組織至尾椎骨面，向兩側(cè)分離，充分顯露尾椎間隙，橫向切開尾椎纖維環(huán)取出2個椎間盤的髓核組織，移植至左側(cè)L5DRG周圍。用生理鹽水沖洗傷口，傷口撒青霉素粉4萬U，最后依次縫合各層，碘伏消毒后將大鼠置于溫暖、安靜、干凈、避強(qiáng)光的環(huán)境中分籠飼養(yǎng)。術(shù)后注意預(yù)防感染，模型大鼠出現(xiàn)左足蜷縮、畏懼著地、患肢自覺抬起的現(xiàn)象，且足底機(jī)械痛閾明顯下降視為手術(shù)成功。

（3）鞘內(nèi)給予神經(jīng)妥樂平

實驗組（LDH + NTP組）：鞘內(nèi)置管，置管7 d大鼠恢復(fù)正常后制備LDH模型，術(shù)后3 d開始行NTP（生產(chǎn)批號：14045日本臟器制藥株式會社）10 μl鞘內(nèi)注射，每天1次，連續(xù)給藥7 d；假手術(shù)組（Sham組）：鞘內(nèi)置管，置管7 d大鼠恢復(fù)正常后制備假LDH模型，僅顯露硬脊膜及左側(cè)L5 DRG，不進(jìn)行自體髓核移植，術(shù)后3 d開始行生理鹽水10 μl鞘內(nèi)注射，每天1次，連續(xù)7 d；對照組（LDH + Saline組）：鞘內(nèi)置管，置管7 d大鼠恢復(fù)正常后制備LDH模型，術(shù)后3 d開始行生理鹽水10 μl鞘內(nèi)注射，每天1次，連續(xù)7 d。每組每只大鼠均進(jìn)行行為學(xué)測試，結(jié)束后取大鼠L3-L5背根神經(jīng)節(jié)，用Western-blot法檢測L3-L5DRG中炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。

3.檢測大鼠機(jī)械痛閾

機(jī)械縮足閾值(PWT)測定：LDH術(shù)前1 d、術(shù)后3 d及鞘內(nèi)給藥后1 d、3 d、7 d時測定PWT。行為學(xué)測試前三天每日將大鼠放在透明塑料鼠籠中20～30 min適應(yīng)。每次測定時間均在8:00～12:00 am，所有行為學(xué)測試均由同一人完成，測試人員不知道大鼠分組情況。參照Chaplan等“up and down”方法，于安靜、光線充足的實驗環(huán)境內(nèi)，將大鼠放置于金屬網(wǎng)格(1 cm×1 cm)上的透明塑料鼠籠（20 cm×20 cm×20 cm）內(nèi)，金屬網(wǎng)格架空，大鼠于鼠籠內(nèi)可自由活動。放置20～30 min，大鼠安靜后，透過網(wǎng)孔使用特定的Von Frey纖維絲（0.4 g、0.6 g、1 g、2 g、4 g、6 g、8 g、15 g）垂直刺激大鼠左后足底中部，避開不敏感的足墊部，觀察并記錄大鼠的反應(yīng)。von Frey纖維絲刺激的力度：應(yīng)使纖維絲彎曲成S形（90°～120°），刺激時間4 s，若大鼠出現(xiàn)迅速縮足、后足抬起、快速甩尾、舔足、嘶叫等反應(yīng)，則記為“O”，沒有上述反應(yīng)則記為“×”（每個刺激強(qiáng)度允許適當(dāng)重復(fù)，盡量避免誤差）。首先從2.0 g的von Frey纖維絲開始，若縮足反應(yīng)為陰性，則選用增大一個強(qiáng)度的von Frey纖維絲繼續(xù)刺激；若縮足反應(yīng)為陽性，則選擇減少一個強(qiáng)度的von Frey纖維絲刺激，如此反復(fù)。停止刺激的條件：①von Frey纖維絲最大刺激強(qiáng)度15 g刺激時仍為陰性反應(yīng)（此時以15 g作為機(jī)械痛閾值）。②第一次出現(xiàn)陽性反應(yīng)后，應(yīng)用“up and down應(yīng)法連續(xù)測試4次。③應(yīng)用“up and down”法累計測試總次數(shù)達(dá)9次。刺激間隔時間30 s，使大鼠完全恢復(fù)。測試結(jié)束，應(yīng)用特定的軟件，將刺激強(qiáng)度（g）轉(zhuǎn)換成縮足閾值（N）（推算公式為50% PWT(g) =(10[Xf+κδ])/10 000，Xf為序列中最后一根von-Frey纖毛的對數(shù)值，δ為各個纖毛力度取對數(shù)后的均差，κ查表得來）。

4.檢測大鼠DRG中IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)

鞘內(nèi)給藥7 d后，行為學(xué)測試后處死大鼠，提取DRG組織，組織裂解液裂解后用電動勻漿器研磨，充分勻漿后置于4℃冰箱90 min，使其充分裂解，然后將組織液放入低溫離心機(jī)離心(4 ℃，12 000 rpm,20 min)，取上清液用BCA法測定蛋白濃度。待測樣品加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，放入100℃沸水使其變性10 min，冷卻后分裝。取50μg/孔蛋白樣品上樣，進(jìn)行 SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后切取目的蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h后加入相應(yīng)的多克隆一抗IL-1P（1:150，武漢博士德生物武漢）、IL-6（1:150，武漢博士德生物武漢）、TNF-α（1:200，武漢博士德生物武漢）和β-actin（1:1 000，武漢博士德生物武漢），4℃搖床過夜，洗膜后加入相應(yīng)的二抗孵育，采用ECL發(fā)光試劑盒（武漢博士德生物武漢）和化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（ProteinSimple美國），曝光洗片，掃描圖像后用圖像分析系統(tǒng)對Western 蛋白條帶進(jìn)行分析，蛋白的相對含量用目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶光密度的比值表示，按計量資料進(jìn)行統(tǒng)計分析。

5.統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示，各組數(shù)據(jù)根據(jù)分布的情況選用不同的統(tǒng)計方法。組內(nèi)比較采用重復(fù)測量資料的方差分析，多組定量資料的比較采用One-way ANOVA單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜ 0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.各組大鼠機(jī)械刺激縮足閾值(PWT)的測定與比較

所有大鼠術(shù)后均未出現(xiàn)肢體自噬現(xiàn)象，均可正常飲食飲水，但LDH + NTP組及LDH + Saline組大鼠易激惹、活動頻繁，隨著LDH + NTP組用藥時間的延長，大鼠行為逐漸恢復(fù)。

與基礎(chǔ)PWT相比，Sham組術(shù)后各時間點左后足底機(jī)械刺激縮足閾值無明顯變化，LDH + NTP組及LDH + Saline組大鼠左后足底機(jī)械刺激縮足閾值明顯降低；第一次給藥后1 d、3 d、7 d，LDH + NTP組PWT高于LDH + Saline組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05，見圖1）。結(jié)果表明：自體髓核移植可引發(fā)大鼠的痛覺過敏；鞘內(nèi)注射NTP可緩解LDH大鼠的痛覺過敏。

2.各組大鼠DRG中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)變化

IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白在三組大鼠DRG中均有表達(dá)，與Sham組相比，LDH + NTP組與LDH +Saline組表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜ 0.05)；但LDH + NTP組表達(dá)低于LDH + Saline組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05，見圖2）。結(jié)果表明：LDH大鼠DRG中炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)增加，而鞘內(nèi)注射NTP可減少LDH大鼠DRG中炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。

圖1 LDH大鼠術(shù)后不同時間點PWT變化(±SD)**P ＜ 0.01，與 Sham 組相比；#P ＜ 0.05，與 LDH +Saline組相比Fig.1 Changes of PWTs at different time points in rats after LDH operation in each group (±SD)**P ＜ 0.01, compared with Sham group; #P ＜ 0.05,compared with LDH + Saline group.

討 論

LDH導(dǎo)致腰痛和坐骨神經(jīng)痛的病理生理機(jī)制非常復(fù)雜，目前認(rèn)為LDH引起疼痛的主要原因包括機(jī)械性直接壓迫神經(jīng)根和免疫性炎癥反應(yīng)，兩者共同作用導(dǎo)致臨床常見的腰痛及受累神經(jīng)根的放射性疼痛[6,7]。神經(jīng)根組織無論受到何種因素?fù)p傷都可以使得炎癥部位的細(xì)胞膜釋放磷脂，并降解為花生四烯酸，由此轉(zhuǎn)化為強(qiáng)效的炎癥致痛物質(zhì)前列腺素和白三烯，即周圍性疼痛致敏物質(zhì)[7,8]，受到直接性壓迫后發(fā)生組織缺血、缺氧、水腫，這是產(chǎn)生典型臨床癥狀的重要誘因。本實驗參照Shu-Xun H等[9]制備大鼠LDH模型的方法，將自體髓核移植至大鼠背根神經(jīng)節(jié)，可較好的誘導(dǎo)出大鼠神經(jīng)行為學(xué)的改變，更接近于臨床，而未產(chǎn)生明顯的運動功能障礙。本實驗結(jié)果表明，LDH模型后大鼠出現(xiàn)左足蜷縮、畏懼著地、患肢自覺抬起的現(xiàn)象，術(shù)后三天至一周左右即可出現(xiàn)明顯的痛覺過敏，與Xiang Zhu等[10]的研究結(jié)果相符，均提示本模型成功。

LDH是引起坐骨神經(jīng)痛最常見的原因，目前越來越多的學(xué)者關(guān)注其是否與免疫機(jī)制有關(guān)，尤其是自身免疫的機(jī)制[11～13]。近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞和免疫細(xì)胞所產(chǎn)生的免疫因子是 LDH神經(jīng)損傷的一個重要的免疫學(xué)機(jī)制[14～16]。LDH動物模型中，炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α等的表達(dá)明顯增加，而這些炎癥細(xì)胞因子有明顯的致痛覺過敏作用。本研究發(fā)現(xiàn)腰椎間盤突出大鼠DRG中炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)增加，亦提示神經(jīng)根的炎癥與腰椎間盤突出致神經(jīng)根痛的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。神經(jīng)根的炎癥反應(yīng)是腰椎間盤突出所引起的一系列病理生理改變的啟動環(huán)節(jié)。炎癥反應(yīng)釋放的化學(xué)介質(zhì)如細(xì)胞因子等，能夠敏化和刺激傷害性感受器，進(jìn)而引發(fā)痛覺過敏。此外有研究證實，NSAIDs藥物可通過抗炎鎮(zhèn)痛作用緩解腰椎間盤突出病人臨床癥狀；使用COX-2抑制劑[17]、抗炎癥細(xì)胞因子的抗體，可降低髓核移植引起的機(jī)械及熱痛覺過敏；應(yīng)用TNF-α抑制劑，可抑制髓核移植引起的形態(tài)學(xué)改變及疼痛學(xué)行為改變[18]。因此，抑制神經(jīng)根的炎癥反應(yīng)，可緩解腰椎間盤突出所致神經(jīng)根痛的癥狀。

圖2 大鼠DRG中炎癥細(xì)胞因子的相對表達(dá)(±SD)*P ＜ 0.05，與Sham組相比；#P ＜ 0.05，與LDH + Saline組相比Fig.2 Relative expression of inflammatory cytokines in DRG of rats(±SD)*P ＜ 0.05, compared with Sham group; #P ＜ 0.05, compared with LDH + Saline group.

本實驗建立大鼠腰椎間盤突出模型，觀察鞘內(nèi)注射神經(jīng)妥樂平對腰椎間盤突出大鼠的鎮(zhèn)痛作用及脊髓背根神經(jīng)節(jié)炎癥因子表達(dá)的影響，實驗結(jié)果表明，鞘內(nèi)注射神經(jīng)妥樂平可明顯提高腰椎間盤突出大鼠的機(jī)械刺激縮足閾值，減輕腰椎間盤突出大鼠的痛覺過敏；與對照組相比，鞘內(nèi)注射神經(jīng)妥樂平可明顯減少背根神經(jīng)節(jié)中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，神經(jīng)妥樂平可通過下調(diào)炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)，可以調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞的功能，減少炎癥因子的表達(dá)，抑制過度的炎癥反應(yīng)，減輕神經(jīng)根的炎癥損傷，對腰椎間盤突出癥大鼠產(chǎn)生抗炎鎮(zhèn)痛作用，但神經(jīng)妥樂平下調(diào)炎癥因子表達(dá)的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。