胡興國 宋立娟 張勵才

（1湖南省桃源縣人民醫(yī)院麻醉科，桃源415700；2山東省濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院麻醉科，濱州256600；3徐州醫(yī)科大學江蘇省麻醉學重點實驗室&江蘇省麻醉與鎮(zhèn)痛應用技術重點實驗室，徐州221004）

持續(xù)性術后痛(persistent postoperative pain)又稱術后慢性疼痛(chronic postsurgical pain)，嚴重影響手術病人的預后和生活質量，但其形成和維持的確切機制尚不清楚[1,2]。明確其機制對制定防治措施有重要意義。Flatters[3]提出的大鼠皮膚肌肉切口和牽拉(skin/muscle incision and retraction, SMIR)術后持續(xù)性痛模型，其操作過程模擬了臨床外科手術操作，是一種探討持續(xù)性術后痛機制和治療的新手段。研究證實腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)是神經(jīng)損傷和神經(jīng)炎癥過程早期釋放的重要致炎因子，在炎性痛和神經(jīng)病理性痛的產(chǎn)生中起核心作用[4,5]。組蛋白乙?；揎検且环N重要的表觀遺傳現(xiàn)象，這種修飾可改變基因活性，調控基因表達。組蛋白乙?；缴呖墒谷旧w結構松解，促進基因轉錄表達。有研究表明，炎性痛、神經(jīng)病理性痛及切口痛均存在組蛋白乙?；降漠惓6,7]。在炎性痛、神經(jīng)病理性痛模型中全身性或鞘內給予組蛋白去乙?；?histone deacetylase, HDAC)抑制劑具有確切的鎮(zhèn)痛作用和增強阿片類藥物的鎮(zhèn)痛效應[7]。本課題組前期研究表明脊髓TNF-α和組蛋白乙酰化也參與了大鼠皮膚/肌肉切口和牽拉(skin/muscle incision and retraction, SMIR)持續(xù)性術后痛的形成和維持[8～10]。但組蛋白乙?；瘜Τ掷m(xù)性術后痛時脊髓TNF-α的影響仍不清楚，因此本研究擬通過給予HDAC抑制劑，評價組蛋白乙酰化對持續(xù)性術后痛時脊髓TNF-α含量的調控作用。

方 法

1.主要試劑與儀器

辛二酰苯胺異羥肟酸（SAHA，Sigma公司，美國），曲古霉素A（TSA，Sigma公司，美國），TNF-α酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒（上海依科賽公司），IITC電子鎮(zhèn)痛測試儀（IITC Life Scienc公司，美國）。

2.實驗動物

清潔級健康雄性SD大鼠，體重200～250 g，2月齡，由徐州醫(yī)科大學實驗動物中心提供。安靜環(huán)境，室溫19～25℃，晝夜交替，自由獲取水和食物，適應環(huán)境1周后開始實驗。本實驗均遵從國際疼痛學會相關指南，以盡量減少實驗動物數(shù)目及對實驗動物的傷害為原則，并經(jīng)徐州醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會的許可。

3.鞘內置管

采用改良腰部鞘內置管法行鞘內置管[11]：大鼠水合氯醛400 mg/kg 腹腔注射麻醉后取俯臥位，摸清兩側髂棘連線為L6，背部剃毛消毒后在L5-6間隙處作長約為2.5 cm的皮膚縱切口，切開該處背棘肌筋膜，分離L6棘突兩側肌肉，切除部分L6棘突以暴露L5與L6棘突間隙，用小針穿破硬膜可見甩尾，夾取PE-10導管沿穿刺孔插入可見甩尾，置入約1.5 cm，可見腦脊液流出或注入生理鹽水可見水回流。封背部外露約2 cm固定。于置管后1 d取無運動障礙的大鼠鞘內注射2%利多卡因20 μl，注藥后30 s內未出現(xiàn)雙下肢麻痹的剔除本研究。

4.大鼠SMIR持續(xù)性術后痛模型的建立

按Flatters法[3]建立大鼠SMIR持續(xù)性術后痛模型。水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉后仰臥位固定，在大腿中部隱靜脈內側4 mm處做一長1.5～2 cm的皮膚切口暴露腿部肌肉，然后于淺層肌肉（股薄?。┳鲆婚L7～10 mm切口，鈍性分離淺層肌肉，見白色的內收肌群筋膜后，切口內置入顯微牽開器。將牽開器尖頭置入淺層肌肉下后拉開皮膚肌肉至2 cm，暴露內收肌群筋膜，持續(xù)牽拉1 h。在牽拉過程中，隱神經(jīng)被牽開器拉伸并移位，但由于其處于肌肉表層并沒有受堅硬物體如骨頭等的壓迫。牽拉期間大鼠切口處給予無菌生理鹽水紗布覆蓋保濕并保溫，1 h后縫合皮膚肌肉，手術后常規(guī)給予抗生素抗感染治療。

5.動物分組

選擇鞘內置管成功的SD雄性大鼠64只，采用隨機數(shù)字表法隨機分為8組(n= 8)：假手術+人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid, ACSF)組（Ⅰ組），假手術+溶媒二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)組（Ⅱ組），假手術+辛二酰苯胺異羥肟酸（suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA）組（Ⅲ組），假手術+曲古菌素 A（Trichostatin A, TSA）組（Ⅳ組），SMIR + ACSF組（Ⅴ組），SMIR + DMSO組（Ⅵ組），SMIR + SAHA組（Ⅶ組）和SMIR+TSA組（Ⅷ組）。Ⅰ-Ⅳ組行假手術，Ⅴ-Ⅷ組采用Flatters法制備大鼠SMIR持續(xù)性術后痛模型。Ⅰ組和Ⅴ組大鼠于術前1，2，3，4 d及術后1 d每天鞘內注射(i.t.)ACSF 20 μl一次；Ⅱ組和Ⅵ組，Ⅲ組和Ⅶ組，Ⅳ組和Ⅷ組于術前1，2，3，4 d及術后1 d每天分別i.t.DMSO (10 μl)，SAHA (50 μg, 10μl)或 TSA (2 μg,10 μl)，并在每次注藥后經(jīng)導管給予 ACSF 10 μl沖洗導管。

6.機械縮足反應閾(MWT)的測定

于術前1 d (T0)、術后1、3、7、14和21 d (T1-5)時，參照文獻[12]介紹的方法測定MWT。將有機玻璃箱(28 cm×14 cm×16 cm)置于金屬篩網(wǎng)上，大鼠放入玻璃箱中，適應30 min后，用電子麻醉鎮(zhèn)痛測試儀垂直刺激大鼠術側后肢足底中部，逐漸增加刺激強度直至發(fā)生縮足反應，儀器自動記錄壓力值，重復測量5次，每次間隔5 min，取平均值即為MWT。

7.ELISA法檢測脊髓TNF-α含量

T4時MWT測定完畢后，每組隨機取4只大鼠，水合氯醛 400 mg/kg麻醉，迅速斷頭處死取脊髓腰膨大節(jié)段，稱重，按比例加入組織裂解液（100 mg組織加0.4 ml裂解液）。將標本勻漿充分，4℃下14 000 g/min × 10 min離心，收集上清液，在-80℃保存。根據(jù)ELISA試劑盒中說明書操作，波長為450 nm，參考波長為620 nm處，用酶標儀測定光密度，根據(jù)標準曲線算出TNF-α濃度。

8.統(tǒng)計學處理

應用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±SD)表示，各組T1-5與T0值比較采用單因素方差分析；多組間比較采用多因素方差分析。檢驗水準為α = 0.05，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.各組大鼠MWT變化

與T0比較，Ⅰ組大鼠在T1-5時MWT無明顯變化(P＞ 0.05)；與Ⅰ組和T0比較，Ⅱ-Ⅳ組大鼠在T1-5時MWT無統(tǒng)計學差別(P＞ 0.05)，Ⅴ-Ⅷ組大鼠在T2-5時MWT明顯下降(P＜ 0.05)；與Ⅴ組比較，Ⅶ-Ⅷ組大鼠在T3-5時MWT明顯升高（P均 ＜ 0.05）；Ⅴ組與Ⅵ組，Ⅶ組與Ⅷ組分別比較，MWT無統(tǒng)計學差異（P＞ 0.05，見表1）。

2.各組大鼠脊髓TNF-α含量的變化

與Ⅰ組比較，Ⅱ-Ⅳ組大鼠在T4時脊髓TNF-α含量無明顯差別(P＞ 0.05)，Ⅴ-Ⅷ組大鼠在T4時脊髓TNF-α含量明顯升高(P＜ 0.05)；與Ⅴ組比較，Ⅶ-Ⅷ組大鼠在T4時脊髓TNF-α含量明顯下降(P＜ 0.05)；Ⅴ組與Ⅵ組，Ⅶ組與Ⅷ組分別比較，脊髓TNF-α含量無統(tǒng)計學差異（見表2）。

討 論

本研究參照文獻[3,13]介紹的方法制備大鼠持續(xù)性術后痛模型，結果表明，Ⅴ組T2-4時MWT較Ⅰ組明顯降低，提示模型制備成功。本研究參照文獻[14,15]及預實驗結果，選擇鞘內注射羥肟酸類組蛋白去乙?；敢种苿┬炼１桨樊惲u肟酸或曲古菌素 A以及其劑量和給藥時點。參照本課題組前期研究顯示在SMIR術后12～14 d時大鼠機械性痛覺過敏最為明顯[9,10]，選擇T4時檢測脊髓TNF-α含量。

表2 各組大鼠在T4時脊髓TNF-α含量的比較(pg/ml,n = 4,±SD)Table 2 Comparison of the concentration of TNF-α in the spinal cord of rats among different groups at T4(pg/ml, n = 4,±SD)

表2 各組大鼠在T4時脊髓TNF-α含量的比較(pg/ml,n = 4,±SD)Table 2 Comparison of the concentration of TNF-α in the spinal cord of rats among different groups at T4(pg/ml, n = 4,±SD)

#P ＜ 0.05,與Ⅰ組比較，compared with group Ⅰ; △P ＜ 0.05,與Ⅴ組比較，compared with groupⅤ.

TNF-α 含量The concentration of TNF-αⅠ74.7±3.7Ⅱ76.5±2.2Ⅲ 76.8±3.4Ⅳ73.3±4.7Ⅴ126.7±5.1#Ⅵ127.7±6.0#Ⅶ96.2±2.6#△Ⅷ105.7±2.6#△組別Group

表1 各組大鼠MWT的比較(g,±SD)Table 1 Comparison of the MWT in each group of rats (g,±SD)

表1 各組大鼠MWT的比較(g,±SD)Table 1 Comparison of the MWT in each group of rats (g,±SD)

*P ＜ 0.05,與 T0比較，compared with T0 ; #P ＜ 0.05,與Ⅰ組比較，compared with group Ⅰ; △P ＜ 0.05,與Ⅴ組比較，compared with group Ⅴ.

(n = 4)Ⅰ58.5±3.4 60.8±1.8 60.4±2.1 61.0±2.1 62.0±1.5 58.0±3.3Ⅱ59.8±2.8 58.7±3.7 57.5±4.0 57.8±4.2 58.5±3.3 59.6±2.5Ⅲ58.2±3.0 58.0±2.7 57.1±1.6 57.6±1.4 57.4±3.1 61.1±3.2Ⅳ60.4±1.2 58.9±3.3 58.6±2.7 57.1±2.8 59.4±2.2 60.9±2.7Ⅴ59.7±2.8 61.2±1.6 50.3±2.8*# 34.3±1.5*# 29.6±1.8 *# 46.9±2.9*#Ⅵ 58.4±1.7 59.4±2.2 47.4±1.6*# 35.9±2.4*# 28.3±2.4*# 46.3±2.7*#Ⅶ 59.1±2.0 58.3±1.6 48.7±1.2*# 42.1±1.6*#△ 34.5±1.5*#△ 50.7±1.7*#△Ⅷ 60.4±2.2 61.3±1.7 46.7±2.6*# 39.9±1.5*#△ 36.1±2.1*#△ 51.3±2.8*#△組別Group T0T1T2T3T4T5(n = 8)(n = 8)(n = 8)(n = 8)(n = 8)

為了均衡容量、壓力、溶媒二甲基亞砜和辛二酰苯胺異羥肟酸及曲古菌素對實驗結果的影響，本研究設置Ⅰ-Ⅳ組，結果表明，Ⅰ-Ⅳ組MWT、脊髓TNF-α含量無差異?？赏ㄟ^檢測MWT和（或）熱縮足反射潛伏期（PWL）反映持續(xù)性術后痛程度。Flatters[3]及本課題組前期研究[12]表明，SMIR制備持續(xù)性術后痛模型大鼠術后出現(xiàn)機械刺激痛覺過敏，而PWL在術后各時點無差異。故本研究僅檢測MWT。

神經(jīng)元和膠質細胞均可分泌TNF-α。研究證實TNF-α在疼痛中樞敏感化形成中具有重要作用[5]。中樞或外周給予TNF-α均可引起大鼠痛覺過敏和痛覺超敏，能促進前列腺素(PGs)、一氧化氮(NO)以及P物質等大量傷害性遞質或調質的釋放和表達；在外周和中樞神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)病理性痛模型中，脊髓背角及損傷部位TNF-α和TNF受體1顯著上調。在角叉菜膠和酵母多糖誘導的胸膜炎大鼠炎癥模型，發(fā)現(xiàn)TNF-α在激活其他細胞因子（尤其是IL-1β，IL-6和IL-8）級聯(lián)反應中起帶頭作用[16]。本課題組前期[8]的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠SMIR術后第7 d脊髓TNF-α含量明顯增加，術后第12 d達到高峰，并持續(xù)到術后第22 d，與SMIR術后MWT變化基本一致，表明TNF-α的變化與大鼠SMIR持續(xù)性術后痛的發(fā)生發(fā)展有關，進一步證實了脊髓TNF-α的增加參與了大鼠SMIR持續(xù)性術后痛的形成。

研究顯示在慢性疼痛狀態(tài)，影響傷害感受性基因表達的表觀遺傳學因素包括：組蛋白乙?；NA甲基化、非編碼RNA以及染色質重塑，其中組蛋白乙?；诓±硇蕴弁串a(chǎn)生和維持過程中起重要作用[17]。在大鼠坐骨神經(jīng)分支損傷(spared nerve injury, SNI)以及脊神經(jīng)結扎(spinal nerve ligation,SNL)神經(jīng)病理性痛模型中均發(fā)現(xiàn)脊髓背角HDAC表達上調，乙酰化組蛋白3 (Ac-H3)的表達下調，其改變與熱痛覺過敏的發(fā)生相一致[18,19]。在大鼠完全弗式佐劑(complete freund's sadjuvant, CFA)炎性痛模型的研究中也發(fā)現(xiàn)大鼠脊髓背角HDAC表達上調[18]。研究還發(fā)現(xiàn)在炎性痛、神經(jīng)病理性痛模型中全身性或鞘內給予HDAC抑制劑具有確切的鎮(zhèn)痛作用和增強阿片類藥物的鎮(zhèn)痛效應[7,20]，提示組蛋白的乙酰化調節(jié)在神經(jīng)病理性痛和炎性痛的發(fā)展和維持中發(fā)揮重要的作用。本課題組前期[9]的研究結果顯示，SMIR持續(xù)性術后痛組大鼠術后3 d時形成痛覺過敏，持續(xù)至術后21 d，并開始緩解，同時脊髓Ac-H3或Ac-H4術后3 d時表達水平明顯下調，術后21 d時表達開始上調，提示大鼠術后脊髓脊髓背角組蛋白乙?；浇档汀１狙芯勘砻?，與Ⅰ組比較，Ⅴ組大鼠在發(fā)生機械性痛覺過敏的同時，TNF-α含量明顯升高，而鞘內給予HDAC抑制劑SAHA或TSA后，在減輕SMIR引起的機械性痛覺過敏的同時，能部分逆轉SIMR引起的脊髓TNF-α含量的升高，進一步證實了脊髓TNF-α生成增加與SMIR持續(xù)性術后痛的發(fā)生有關，而持續(xù)性術后痛時脊髓TNF-α含量升高部分與組蛋白乙?；惓Ｕ{節(jié)有關，持續(xù)性術后痛引起的脊髓TNF-α含量升高還存在其它方面的機制。

綜上所述，鞘內給予HDAC抑制劑對持續(xù)性術后痛具有鎮(zhèn)痛作用，持續(xù)性術后痛時脊髓TNF-α含量增加可能與組蛋白乙?；惓Ｕ{節(jié)有關。