劉世坤，張?chǎng)紊剑軙郧?，殷濤，劉志?/p>

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津 300192))

1 引 言

在腦科學(xué)及神經(jīng)科學(xué)的研究中，各類物理刺激(如電刺激、磁刺激、光刺激和超聲刺激等)正發(fā)揮著愈加重要的作用，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于腦功能認(rèn)知及腦部神經(jīng)功能性疾病的研究和治療。其中，經(jīng)顱神經(jīng)電刺激有著巨大優(yōu)勢(shì)。早在1874年，美國(guó)的Bartholow在腦手術(shù)中用電極直接電刺激大腦運(yùn)動(dòng)區(qū)引起對(duì)側(cè)肢體抽動(dòng)[1]，揭開了神經(jīng)電刺激用于神經(jīng)調(diào)控的序幕。到今天，通過科學(xué)家們對(duì)神經(jīng)電刺激的探究，神經(jīng)電刺激已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注，并逐步成為科學(xué)研究和臨床診療的重要手段。非侵入的經(jīng)顱神經(jīng)電刺激不僅用于診斷和治療腦神經(jīng)疾病，同時(shí)也可以調(diào)控大腦功能，為探索大腦認(rèn)知過程的機(jī)制，提供了新的支撐技術(shù)。

本研究探討的經(jīng)顱磁聲耦合電刺激(transcranial magneto-acoustic stimulation, TMAS)屬于新型的無創(chuàng)腦神經(jīng)電刺激技術(shù)，即在神經(jīng)組織或組織液中利用靜磁場(chǎng)和超聲波通過霍爾效應(yīng)來產(chǎn)生電流去無損傷地刺激神經(jīng)組織。2003年Norton最先提出借助超聲聚焦性和傳播深度的優(yōu)勢(shì)，將該原理應(yīng)用于電刺激，并對(duì)磁聲耦合電刺激進(jìn)行了理論推導(dǎo)，計(jì)算結(jié)果表明該方法可以產(chǎn)生感應(yīng)電流，并應(yīng)用于刺激目標(biāo)神經(jīng)[2]。與經(jīng)顱磁刺激(transcranial magnetic stimulation, TMS)和經(jīng)顱直流電刺激(transcranial direct current stimulation, tDCS)相比，TMAS具有更高的空間分辨率，因?yàn)門MAS的空間分辨率是由聚焦超聲斑的直徑大小決定，而超聲聲斑較磁場(chǎng)聚焦區(qū)域小。

在此之前，Li曾對(duì)TMAS的刺激原理進(jìn)行了仿真和驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)[3]，驗(yàn)證了該方法的可行性。為進(jìn)一步探究TMAS應(yīng)用于動(dòng)物神經(jīng)刺激的效果，本研究搭建了TMAS實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，設(shè)計(jì)了針對(duì)小鼠的刺激參數(shù)，開展健康鼠和帕金森(parkinson’s disease，PD)模型鼠的在體實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 TMAS技術(shù)的原理

經(jīng)顱磁聲刺激的物理原理是神經(jīng)組織中的離子在超聲波的作用下發(fā)生振動(dòng),因?yàn)殪o磁場(chǎng)與帶電離子的運(yùn)動(dòng)方向垂直，所以在組織中的帶電離子在與靜磁場(chǎng)和振動(dòng)方向均正交的方向產(chǎn)生洛倫茲力，產(chǎn)生的洛倫茲力將正負(fù)離子帶往相反的方向，從而在組織內(nèi)形成刺激電場(chǎng)[4]。

圖1 原理圖

原理圖見圖1，在磁場(chǎng)B0的作用下，當(dāng)超聲波帶動(dòng)導(dǎo)電組織產(chǎn)生相同振動(dòng)速度V的運(yùn)動(dòng)時(shí)，可導(dǎo)電組織中產(chǎn)生的電場(chǎng)E為：

E=VB0

(1)

且組織中粒子振動(dòng)的速度V與超聲聲壓P之間關(guān)系為：

P=ρCsV

(2)

ρ為組織密度，Cs為組織中超聲傳播速度。

將式(2)帶入式(1)得到電場(chǎng)分布情況：

(3)

由于電流密度J=σE，所以組織內(nèi)部電流密度為：

(4)

由式(4)可看出，由于神經(jīng)組織中ρ與Cs不變，磁聲耦合刺激產(chǎn)生的電場(chǎng)與電流密度僅與磁場(chǎng)強(qiáng)度和聲壓有關(guān)，且該電場(chǎng)方向?yàn)殪o磁場(chǎng)與聲束振動(dòng)方向的矢量積方向；即在靜磁場(chǎng)大小不變時(shí)，電流大小與超聲聲壓成線性關(guān)系。

2.2 小動(dòng)物TMAS系統(tǒng)

為了進(jìn)行在體小動(dòng)物的磁聲耦合刺激實(shí)驗(yàn)，搭建了一套針對(duì)小動(dòng)物的在體TMAS實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，包括超聲激勵(lì)發(fā)生裝置、靜磁鐵、超聲換能器及小動(dòng)物固定裝置、呼吸麻醉裝置等，見圖2。

圖2系統(tǒng)示意圖

Fig2Systemdiagram

圖2中設(shè)備分別為①腦立體定位儀，②超聲換能器，③超聲準(zhǔn)直器，④靜磁鐵，⑤函數(shù)發(fā)生器，⑥門控放大器，⑦呼吸麻醉系統(tǒng)。

在TMAS實(shí)驗(yàn)中，首先在函數(shù)信號(hào)發(fā)生器(AFG3252，Tektronix，美國(guó))設(shè)定實(shí)驗(yàn)需要的超聲信號(hào)，經(jīng)由高能門控放大器(GA-2500A，RITEC，美國(guó))放大，將脈沖信號(hào)伏值提至1 000 V形成超聲激勵(lì)信號(hào)，驅(qū)動(dòng)定制聚焦型超聲換能器(主頻1 MHz，焦距2.35 cm，焦點(diǎn)直徑2 mm，中科院聲學(xué)所制)產(chǎn)生豎直方向的超聲聲束，聲束通過超聲準(zhǔn)直器(注滿超聲耦合劑的錐形筒，減少超聲在空氣中傳播產(chǎn)生的衰減)到達(dá)小鼠頭皮進(jìn)行刺激。實(shí)驗(yàn)用鼠固定在電磁兼容型腦立體定位儀上，并在實(shí)驗(yàn)過程中使用呼吸麻醉系統(tǒng)(R520IP，瑞沃德，中國(guó)深圳)保持麻醉，同時(shí)在鼠頭部一側(cè)放置靜磁鐵提供水平方向的穩(wěn)恒磁場(chǎng)。

2.3 參數(shù)選擇與真實(shí)顱內(nèi)聲壓檢測(cè)

綜合考慮磁聲耦合電場(chǎng)強(qiáng)度及超聲安全，本實(shí)驗(yàn)中所使用的超聲刺激信號(hào)為主頻1 MHz，脈沖寬度200 μs，重復(fù)頻率1 Hz的超聲波脈沖，每次刺激時(shí)間持續(xù)2 min，共120個(gè)脈沖，波形見圖3。

系統(tǒng)中靜磁場(chǎng)強(qiáng)度為0.3 T，由高斯計(jì)(475DSP，Lakeshore，美國(guó))測(cè)試獲得。

圖3 超聲信號(hào)與參數(shù)

為了獲得本TMAS系統(tǒng)以及所使用參數(shù)在小動(dòng)物顱內(nèi)所產(chǎn)生的真實(shí)聲壓，將一只C57BL/6J小鼠麻醉后頸椎脫臼處死，頭部固定于實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，頭頂脫毛，涂抹超聲耦合劑，并將換能器置于其頭部形成刺激點(diǎn)，在最大限度不影響顱內(nèi)密閉性的前提下，將針式水聽器(1 MHz下靈敏度2.71 uV/Pa，中科院聲學(xué)所制)穿過小鼠的下顎，深入顱內(nèi)，并將調(diào)整針式水聽器方向，使其與超聲換能器聲束在同一直線。之后開啟超聲刺激設(shè)備，在示波器中同步檢測(cè)超聲發(fā)射信號(hào)與水聽器檢測(cè)信號(hào)，從而得出在超聲脈沖發(fā)射時(shí)，小鼠顱內(nèi)的真實(shí)聲壓，測(cè)得在本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)下，上述參數(shù)可以在小鼠顱內(nèi)產(chǎn)生約3.1 MPa的瞬時(shí)聲壓。

2.4 在體小動(dòng)物的TMAS實(shí)驗(yàn)

2.4.1健康小鼠的TMAS實(shí)驗(yàn) 首先使用健康小鼠進(jìn)行了TMAS實(shí)驗(yàn)，選取同親C57BL/6J雄性小鼠8只，體重18～22 g，7～8周齡。安靜環(huán)境飼養(yǎng)，自由取食飲水。實(shí)驗(yàn)中，將上述小鼠隨機(jī)均分成對(duì)照組，磁聲耦合刺激組，每組4只。首次實(shí)驗(yàn)時(shí)剃除小鼠頭部外層毛發(fā)，并使用生理鹽水沖洗清洗干凈皮膚。每次實(shí)驗(yàn)開始前，先使用4%濃度的異氟烷對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉。使小鼠被腦立體定位儀固定，固定后改為1%濃度異氟烷維持麻醉狀態(tài)。在小鼠頭部皮膚涂抹超聲耦合劑，將小鼠置于2.2實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中。其中磁聲耦合刺激組將小鼠腦部置于強(qiáng)度為0.3 T的水平方向靜磁場(chǎng)下，同時(shí)超聲換能器使用2.3中的參數(shù)在海馬區(qū)黑質(zhì)豎直方向發(fā)射超聲波，持續(xù)2 min，每d 1次，連續(xù)10 d。對(duì)照組小鼠僅固定在腦立體定位儀上，將換能器置于頭皮上，并關(guān)閉超聲激勵(lì)，持續(xù)2 min，每d 1次，連續(xù)10 d[5-6]。

2.4.2PD模型小鼠的TMAS實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)中使用8只由腹腔注射MPTP造模形成的PD模型鼠，全部通過爬桿測(cè)試完成PD驗(yàn)?zāi)7]。也將該8只PD小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組，TMAS組，每組4只。實(shí)驗(yàn)中使用的刺激參數(shù)與刺激方案均與2.4.1中的健康鼠實(shí)驗(yàn)方案相同。

3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論

3.1 健康小鼠的TMAS實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在刺激結(jié)束之后2 d，即從開始刺激起第12 d，對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行了高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)以及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，對(duì)其主動(dòng)學(xué)習(xí)與探索記憶能力進(jìn)行檢測(cè)。

高架十字迷宮由兩個(gè)相對(duì)的開放臂，兩個(gè)相對(duì)的封閉臂組成的十字型迷宮，放置在離地50 cm的支架上。實(shí)驗(yàn)利用動(dòng)物對(duì)新異環(huán)境的探究特性和對(duì)高懸敞開臂的恐懼形成矛盾沖突來考察動(dòng)物的焦慮狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)指標(biāo)主要關(guān)注進(jìn)入開放臂探索的距離和在開放臂停留時(shí)間的百分比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

a.各組小鼠在開放臂停留時(shí)間百分比 b.各組小鼠在開放臂運(yùn)動(dòng)距離(cm)(對(duì)照組為C，磁聲刺激組為M)

Fig4Resultsofelevatedplusmazetest(C：controlgroup，M：TMASgroup)

a．the percentage of time mice stay in open arm b．the distance mice progress in open arm

在開放臂中向下探究的時(shí)間百分比反應(yīng)在動(dòng)物的探索行為，代表動(dòng)物對(duì)陌生環(huán)境的好奇探索或逃避；進(jìn)入開放臂探索的距離反應(yīng)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)能力[8-9]。

圖5各組小鼠在曠場(chǎng)中心停留、探索時(shí)間(對(duì)照組為C，磁聲刺激組為M)

Fig5Durationsofmicestayatthecenterofopen-field(C:controlgroup，M:TMASgroup)

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)可以觀察研究動(dòng)物進(jìn)入開闊環(huán)境后的各種行為，以此評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在新異環(huán)境中的自主探究行為。

圖5中實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，磁聲刺激組小鼠在主動(dòng)探索學(xué)習(xí)能力方面和運(yùn)動(dòng)能力方面顯著高于對(duì)照組。僅從行為學(xué)的結(jié)果來看，磁聲耦合刺激對(duì)腦海馬區(qū)灰質(zhì)神經(jīng)確實(shí)有一定的改善作用。

3.2 PD模型小鼠的TMAS實(shí)驗(yàn)結(jié)果

刺激結(jié)束后2 d，即開始刺激后的第12 d，對(duì)各組小鼠進(jìn)行腦海馬區(qū)突觸活性的長(zhǎng)時(shí)程增量(LTP)和去長(zhǎng)時(shí)程增量(DP)電生理檢測(cè)[10]。

圖6各組PD小鼠LTP與DP結(jié)果(對(duì)照組為PC，磁聲耦合刺激組為PM)

Fig6ResultsofLTPandDPcollectedfromdifferentgroup(C:controlgroup，M:TMASgroup)

海馬突觸活性的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)作為突觸可塑性的研究模型，與動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力有著十分直接的聯(lián)系，在圖6中記錄的興奮性突觸后場(chǎng)電位(field excitatory postsynaptic potential，fEPSP)可以看出，在給予海馬區(qū)神經(jīng)突觸高頻節(jié)律刺激(TBS)之后，成功誘發(fā)出LTP，并且磁聲組模型鼠的fEPSP的增強(qiáng)速率明顯高于對(duì)照組。在給予低頻刺激(LFS)后，引起DP后，磁聲刺激組fEPSP回升速率較快。

上述結(jié)果均表明經(jīng)顱磁聲耦合刺激可以有效地調(diào)節(jié)PD模型鼠海馬區(qū)黑質(zhì)神經(jīng)，使其突觸活性及可塑性提高，從而提高學(xué)習(xí)與記憶能力[11]。

3.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的討論及分析

經(jīng)顱磁聲刺激本質(zhì)上是一種聚焦電刺激。本研究由圖4、5、6可知，利用經(jīng)顱磁聲耦合刺激在小鼠腦黑質(zhì)區(qū)作用10 d后，無論健康鼠還是PD模型鼠，其運(yùn)動(dòng)功能以及學(xué)習(xí)記憶能力均得到改善，改善的效果為TMAS組優(yōu)于對(duì)照組。初步證明了TMAS技術(shù)對(duì)小動(dòng)物經(jīng)顱聚焦刺激的有效性。

本實(shí)驗(yàn)中，由于TMAS技術(shù)中同時(shí)產(chǎn)生超聲刺激和磁聲耦合電刺激的神經(jīng)刺激，作用的效果可能僅由電刺激作用直接引起，也可能是由超聲刺激的輻射力效應(yīng)間接引起，還有可能是兩者共同作用的綜合效應(yīng)。

在使用本系統(tǒng)的超聲信號(hào)進(jìn)行TMAS時(shí)，實(shí)驗(yàn)中小鼠顱內(nèi)瞬時(shí)聲壓達(dá)到3.1 MPa，系統(tǒng)中靜磁場(chǎng)的強(qiáng)度B0=0.3 T，Cs=1515 m/s，ρ=1028 kg/m3，σ=0.5 S/m[12]，根據(jù)磁聲耦合效應(yīng)產(chǎn)生的電場(chǎng)與電流密度公式可以得出，其電場(chǎng)強(qiáng)度為0.597 V/m，電流密度為0.299 A/m2。由此可知，在現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)前提下，實(shí)際刺激中在目標(biāo)神經(jīng)區(qū)域產(chǎn)生的電場(chǎng)強(qiáng)度遠(yuǎn)小于經(jīng)典的直接電磁刺激技術(shù)，如TMS以及DBS，并未達(dá)到神經(jīng)動(dòng)作電位閾值(參考文獻(xiàn)[13-15]，一般認(rèn)為能引起神經(jīng)動(dòng)作電位的閾值為100 V/m)，屬于閾下刺激。

經(jīng)顱聚焦超聲刺激(transcranial ultrasound stimulation,TUS)的機(jī)制[16-18]已經(jīng)被多次闡述，通過機(jī)械效應(yīng)改變細(xì)胞離子通道閾值，進(jìn)而影響神經(jīng)細(xì)胞活動(dòng)。根據(jù)參考各課題組在TUS領(lǐng)域所做的研究，TUS中超聲參數(shù)的選擇更加注重的是超聲所攜帶的能量[19-20]，而非磁聲耦合電刺激中的聲壓。本實(shí)驗(yàn)中所選用的超聲參數(shù)雖瞬時(shí)聲壓較高，但是實(shí)際占空比低，超聲所攜帶的平均能量較低，Ispta=63 mW/cm2，超聲能量十分微弱。

綜上論述，本研究開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了TMAS的有效性。由在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們初步認(rèn)為，TMAS技術(shù)是結(jié)合了超聲刺激的力學(xué)機(jī)械效應(yīng)與磁聲耦合電場(chǎng)的電學(xué)效應(yīng)，其本質(zhì)上是在刺激靶區(qū)產(chǎn)生這兩種效應(yīng)的復(fù)合效果。對(duì)于TMAS的作用效果及機(jī)制仍需更深入的探討，這也是我們未來的主要研究工作。

4 總結(jié)

本研究根據(jù)經(jīng)顱磁聲耦合刺激原理，搭建小動(dòng)物TMAS實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，進(jìn)行小動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)，刺激后的行為學(xué)及電生理結(jié)果驗(yàn)證了TMAS在在體動(dòng)物上可有效改善運(yùn)動(dòng)功能，提高神經(jīng)突觸活性，并基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析及討論了TMAS的作用機(jī)制。本研究的結(jié)果對(duì)TMAS的在體應(yīng)用有一定的參考價(jià)值，為進(jìn)一步分析TMAS作用于神經(jīng)的實(shí)際效果機(jī)制打下了基礎(chǔ)。