黃冬梅，李福祥

（1.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，四川 瀘州 646099；2.西南醫(yī)科大學 臨床醫(yī)學院，四川 瀘州 646000）

肺鱗狀細胞癌（lung squamous cell carcinoma,LSCC）是我國常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。MicroRNAs是一類長度在25個核苷酸以內(nèi)的單鏈、短序列RNA[2]。MicroRNAs通過結(jié)合靶基因信使RNA的3’端非編碼區(qū)來抑制靶基因的表達[3]。研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-149（miR-149）的異常表達與肝癌、胃癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3-4]。因而，miR-149被認為是一種具有潛在應(yīng)用價值的腫瘤評估指標。本研究通過檢測miR-149在LSCC中的表達及其在癌細胞轉(zhuǎn)移中的作用機制，以期為LSCC的診治提供新的分子靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年1月-2015年12月于西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科就診的60例LSCC患者的癌灶及癌旁組織。其中，男性32例，女性28例；患者年齡35～61歲。人肺上皮細胞BEAS-2B和LSCC細胞系YTMLC-90、HB-99及NCI-H226購自中國科學院上海細胞庫。杜爾伯科極限必需培養(yǎng)基（Dulbecco minimum essential medium, DMEM）（11965-084）、胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）（16000044）購自美國Gibco公司，RNA提取試劑（Trizol，15596026）、LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑（L3000015）及一步法RT-PCR試劑盒（10928042）購自美國Invitrogen公司，miR-149 mimics、陰性對照mimics、miR-149 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）引物試劑盒及RNU6B qRT-PCR引物試劑盒購自廣州銳博基因有限公司，叉頭盒蛋白M1（forkhead box protein M1，F(xiàn)OXM1）引物（正向引物：5’-GGGCGCACGGCGGAAGATGAA-3’；反向引物 ：5’-CCACTCTTCCAAGGGAGGGCTC-3’）、 基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）引物（正向引物：5’-CAGGACATTGTCTTTGATGG CATCGC-3’；反向引物：5’-TGAAGAAGTAGCTAT GACCACCGCC-3’）及GAPDH引物（正向引物：5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’；反向引物 ：5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’） 由上海生工生物工程股份有限公司合成，Transwell小室（#3458）（美國康寧公司），Matrigel（354230）（美國B&D 公司），F(xiàn)OXM1（ab83097）、MMP-2（ab37150）及GAPDH（ab9485）抗體（美國Abcam公司），ECL化學發(fā)光試劑盒（WBKLS0050）（美國密理博公司）。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR 通過Trizol試劑提取標本及細胞RNA，配制逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴增體系。逆轉(zhuǎn)錄條件為：50℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，94℃失活2 min，循環(huán)1次后94℃變性15 s，60℃退火30 s，68℃延伸3 min，共40個循環(huán)后72℃繼續(xù)延伸10 min。通過2-△△Ct法檢測miR-149的相對含量。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及mimics轉(zhuǎn)染 NCI-H226細胞在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至穩(wěn)定傳代2～3代。過夜增殖至愈合度達70%，接種6孔細胞培養(yǎng)板。miR-149組由100 pmol miR-149模擬物及5μl轉(zhuǎn)染試劑構(gòu)成；miR-NC組由100 pmol的陰性對照模擬物及5μl轉(zhuǎn)染試劑構(gòu)成。用無血清DMEM培養(yǎng)液添加至1 ml/孔。4 h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 細胞劃痕愈合試驗 將轉(zhuǎn)染24 h后的NCI-H226細胞接種于6孔板中，接種密度以過夜鋪滿為準。無血清DMEM培養(yǎng)基饑餓細胞4 h減弱細胞間連接。用100μl的槍頭由每孔中線劃過，PBS清洗6孔板，使用無血清DMEM培養(yǎng)基補充至2 ml/孔。培養(yǎng)48 h后觀察細胞的遷移。

1.2.4 Transwell小室 基質(zhì)膠按1∶8稀釋后，在Transwell小室膜的上室面加入100 ul/孔基質(zhì)膠，上層加入250μl細胞懸液，25孔板內(nèi)加入含10% FBS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h。擦凈上室面細胞，4%多聚甲醛固定剩余細胞后使用Giemsa染液染色。統(tǒng)計下室面細胞個數(shù)，以每個小室的平均細胞數(shù)為最終計數(shù)。

1.2.5 Western blot檢測 提取轉(zhuǎn)染72 h后的NCI-H226細胞總蛋白。10% SDS-PAGE膠垂直電泳分離蛋白，采用BIO-RAD濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)，70 V恒壓轉(zhuǎn)膜150 min，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；用5%脫脂奶粉溶液按1∶1 000稀釋FOXM1、MMP-2及GAPDH抗體。在4℃條件下孵育相應(yīng)條帶過夜。洗去殘余一抗后采用1∶5 000稀釋的HRP標記山羊抗兔或抗鼠二抗室溫孵育條帶1 h。于暗室內(nèi)，用ECL法發(fā)光觀察蛋白表達。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析；計數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-149在LSCC中的表達

miR-149在LSCC中的相對表達量為（2.116±0.107），在癌旁組織為（8.763±0.341），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.241，P=0.040）。以LSCC組織中miR-149平均表達水平為界，將60例患者分成miR-149高表達組（≥2.116）23例和miR-149低表達組（＜2.116）37例。對兩組患者的臨床病理特征進行分析，LSCC組織中miR-149高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)（P＜0.05）。見附表和圖1。

圖1 miR-149在LSCC組織中的相對表達量

附表 不同影響因素的miR-149高表達率比較

2.2 過表達miR-149對NCI-H226轉(zhuǎn)移能力的影響

BEAS-2B、YTMLC-90、HB-99及 NCI-H226細胞中miR-149相對表達量分別為（1.035±0.003）、（0.577±0.108）、（0.564±0.101） 和（0.382±0.084），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=41.860，P=0.038）。與BEAS-2B 比較，NCI-H226、YTMLC-90及HB-99細胞中miR-149的表達量均降低（見圖2）。利用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)在NCI-H226細胞內(nèi)過表達miR-149，miR-NC組和miR-149組的miR-149相對表達量分別為（1.042±0.021）和（5.462±0.105），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.031，P=0.010）（見圖 3）。細胞劃痕愈合結(jié)果顯示，miR-NC組和miR-149組劃痕剩余距離百分比分別為（46.414±5.561）%和（78.083±7.133）%，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.119，P=0.024），過表達 miR-149能抑制NCI-H226細胞遷移（見圖4）。Transwell小室結(jié)果表明，miR-NC組和miR-149組侵襲細胞分別為（462.546±8.475） 和（37.194±7.281） 個， 經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.247，P=0.019），過表達miR-149能抑制NCI-H226細胞侵襲（見圖5）。

圖2 miR-149在肺上皮細胞和LSCC細胞中的表達水平比較 （±s）

圖3 兩組miR-149相對表達量比較 （±s）

2.3 miR-149靶向下調(diào)NCI-H226細胞內(nèi)FOXM1的表達

通過對TARGETSCAN及MIRANDA等生物信息學數(shù)據(jù)庫的檢索發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子FOXM1可能是miR-149的下游潛在作用靶點之一。為驗證這一假設(shè)，筆者檢測了過表達miR-149的NCI-H226細胞中FOXM1的表達變化。miR-NC組和miR-149組NCI-H226細胞內(nèi)FOXM1 mRNA的相對表達量分別為（1.043±0.074）和（0.434±0.051），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.083，P=0.032），過表達miR-149能夠下調(diào)NCI-H226細胞內(nèi)FOXM1 mRNA的表達水平（見圖6）。miR-NC組和miR-149組NCI-H226細胞內(nèi)FOXM1蛋白的相對表達量分別為（0.803±0.116）和（0.423±0.065），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.064，P=0.037），過表達miR-149能夠下調(diào)NCI-H226細胞內(nèi)FOXM1蛋白的表達（見圖7）。同時，對細胞遷移和侵襲具有重要促進作用的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2，miR-NC組和miR-149組中MMP-2 mRNA的相對表達量分別為（1.153±0.141） 和（0.412±0.059）， 經(jīng)t檢 驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.310，P=0.021）（見圖 8）。miR-NC組和miR-149組中MMP-2蛋白的相對表達 量 分 別 為（0.760±0.111） 和（0.432±0.109），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.303，P=0.026）（見圖9）。

圖4 miR-149對LSCC細胞遷移的影響

圖5 miR-149對LSCC細胞侵襲的影響

圖 6 兩組 FOXM1 mRNA比較 （±s）

圖7 兩組FOXM1蛋白相對表達量比較 （±s）

圖 8 兩組 MMP-2 mRNA比較 （±s）

圖9 兩組MMP-2蛋白相對表達量比較 （±s）

3 討論

miR-149編碼基因位于人類染色體2q37.3上[5]。miR-149在生理和病理生理過程中發(fā)揮重要作用。例如，在骨關(guān)節(jié)炎患者的軟骨細胞中檢測到miR-149的表達下調(diào)，并且與炎癥調(diào)節(jié)因子白介素6的表達升高有關(guān)，提示miR-149在炎癥發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[6]。除此之外，由吸煙導(dǎo)致的慢性阻塞性肺病細胞中IL-1β和TNF-α的過度分泌也被證實與miR-149表達下調(diào)相關(guān)[7]。近年來對miR-149功能的研究多集中于腫瘤學領(lǐng)域，在腦膠質(zhì)母細胞瘤、結(jié)腸癌、前列腺癌及胃癌中均發(fā)現(xiàn)miR-149的表達下調(diào)[8-11]。

在本研究中，筆者通過對LSCC及癌旁組織的檢測發(fā)現(xiàn)，miR-149在LSCC中的表達明顯降低，并且與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)，提示miR-149可能通過抑制LSCC細胞轉(zhuǎn)移而抑制腫瘤發(fā)展。為此，筆者通過在LSCC的NCI-H226細胞中過表達miR-149并借助劃痕愈合實驗及Transwell小室實驗證明miR-149能夠抑制NCI-H226細胞的遷移和侵襲能力。為探討miR-149的作用機制，筆者通過生物信息學檢索發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXM1可能是miR-149的作用靶點之一。FOXM1已在包括肺癌在內(nèi)的多種人類惡性腫瘤中被證明具有促進腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[12-13]。筆者通過qRT-PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)miR-149負向調(diào)控FOXM1的表達。并且，F(xiàn)OXM1轉(zhuǎn)錄靶點MMP-2的表達水平也受到抑制。MMP-2是一種被廣泛認可的參與分解細胞外機制而促進細胞遷移侵襲的基質(zhì)金屬蛋白酶，其表達改變從分子水平解釋了過表達miR-149后細胞遷移及侵襲能力變化的原因[14]。

綜上所述，miR-149在LSCC中表達下調(diào)并與腫瘤轉(zhuǎn)移表型關(guān)系密切。在體外，miR-149夠通過抑制FOXM1/MMP-2信號通路的表達來抑制LSCC細胞的遷移和侵襲能力，最終抑制腫瘤進展。