黃冬梅，李福祥

（1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，四川 瀘州 646099；2.西南醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000）

肺鱗狀細(xì)胞癌（lung squamous cell carcinoma,LSCC）是我國常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。MicroRNAs是一類長度在25個核苷酸以內(nèi)的單鏈、短序列RNA[2]。MicroRNAs通過結(jié)合靶基因信使RNA的3’端非編碼區(qū)來抑制靶基因的表達(dá)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-149（miR-149）的異常表達(dá)與肝癌、胃癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3-4]。因而，miR-149被認(rèn)為是一種具有潛在應(yīng)用價值的腫瘤評估指標(biāo)。本研究通過檢測miR-149在LSCC中的表達(dá)及其在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，以期為LSCC的診治提供新的分子靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年1月-2015年12月于西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科就診的60例LSCC患者的癌灶及癌旁組織。其中，男性32例，女性28例；患者年齡35～61歲。人肺上皮細(xì)胞BEAS-2B和LSCC細(xì)胞系YTMLC-90、HB-99及NCI-H226購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。杜爾伯科極限必需培養(yǎng)基（Dulbecco minimum essential medium, DMEM）（11965-084）、胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）（16000044）購自美國Gibco公司，RNA提取試劑（Trizol，15596026）、LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑（L3000015）及一步法RT-PCR試劑盒（10928042）購自美國Invitrogen公司，miR-149 mimics、陰性對照mimics、miR-149 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）引物試劑盒及RNU6B qRT-PCR引物試劑盒購自廣州銳博基因有限公司，叉頭盒蛋白M1（forkhead box protein M1，F(xiàn)OXM1）引物（正向引物：5’-GGGCGCACGGCGGAAGATGAA-3’；反向引物 ：5’-CCACTCTTCCAAGGGAGGGCTC-3’）、 基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）引物（正向引物：5’-CAGGACATTGTCTTTGATGG CATCGC-3’；反向引物：5’-TGAAGAAGTAGCTAT GACCACCGCC-3’）及GAPDH引物（正向引物：5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’；反向引物 ：5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’） 由上海生工生物工程股份有限公司合成，Transwell小室（#3458）（美國康寧公司），Matrigel（354230）（美國B&D 公司），F(xiàn)OXM1（ab83097）、MMP-2（ab37150）及GAPDH（ab9485）抗體（美國Abcam公司），ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（WBKLS0050）（美國密理博公司）。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR 通過Trizol試劑提取標(biāo)本及細(xì)胞RNA，配制逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增體系。逆轉(zhuǎn)錄條件為：50℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，94℃失活2 min，循環(huán)1次后94℃變性15 s，60℃退火30 s，68℃延伸3 min，共40個循環(huán)后72℃繼續(xù)延伸10 min。通過2-△△Ct法檢測miR-149的相對含量。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及mimics轉(zhuǎn)染 NCI-H226細(xì)胞在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至穩(wěn)定傳代2～3代。過夜增殖至愈合度達(dá)70%，接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。miR-149組由100 pmol miR-149模擬物及5μl轉(zhuǎn)染試劑構(gòu)成；miR-NC組由100 pmol的陰性對照模擬物及5μl轉(zhuǎn)染試劑構(gòu)成。用無血清DMEM培養(yǎng)液添加至1 ml/孔。4 h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞劃痕愈合試驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染24 h后的NCI-H226細(xì)胞接種于6孔板中，接種密度以過夜鋪滿為準(zhǔn)。無血清DMEM培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞4 h減弱細(xì)胞間連接。用100μl的槍頭由每孔中線劃過，PBS清洗6孔板，使用無血清DMEM培養(yǎng)基補(bǔ)充至2 ml/孔。培養(yǎng)48 h后觀察細(xì)胞的遷移。

1.2.4 Transwell小室 基質(zhì)膠按1∶8稀釋后，在Transwell小室膜的上室面加入100 ul/孔基質(zhì)膠，上層加入250μl細(xì)胞懸液，25孔板內(nèi)加入含10% FBS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h。擦凈上室面細(xì)胞，4%多聚甲醛固定剩余細(xì)胞后使用Giemsa染液染色。統(tǒng)計下室面細(xì)胞個數(shù)，以每個小室的平均細(xì)胞數(shù)為最終計數(shù)。

1.2.5 Western blot檢測 提取轉(zhuǎn)染72 h后的NCI-H226細(xì)胞總蛋白。10% SDS-PAGE膠垂直電泳分離蛋白，采用BIO-RAD濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)，70 V恒壓轉(zhuǎn)膜150 min，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；用5%脫脂奶粉溶液按1∶1 000稀釋FOXM1、MMP-2及GAPDH抗體。在4℃條件下孵育相應(yīng)條帶過夜。洗去殘余一抗后采用1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗兔或抗鼠二抗室溫孵育條帶1 h。于暗室內(nèi)，用ECL法發(fā)光觀察蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)或方差分析；計數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-149在LSCC中的表達(dá)

miR-149在LSCC中的相對表達(dá)量為（2.116±0.107），在癌旁組織為（8.763±0.341），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.241，P=0.040）。以LSCC組織中miR-149平均表達(dá)水平為界，將60例患者分成miR-149高表達(dá)組（≥2.116）23例和miR-149低表達(dá)組（＜2.116）37例。對兩組患者的臨床病理特征進(jìn)行分析，LSCC組織中miR-149高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)（P＜0.05）。見附表和圖1。

圖1 miR-149在LSCC組織中的相對表達(dá)量

附表 不同影響因素的miR-149高表達(dá)率比較

2.2 過表達(dá)miR-149對NCI-H226轉(zhuǎn)移能力的影響

BEAS-2B、YTMLC-90、HB-99及 NCI-H226細(xì)胞中miR-149相對表達(dá)量分別為（1.035±0.003）、（0.577±0.108）、（0.564±0.101） 和（0.382±0.084），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=41.860，P=0.038）。與BEAS-2B 比較，NCI-H226、YTMLC-90及HB-99細(xì)胞中miR-149的表達(dá)量均降低（見圖2）。利用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)在NCI-H226細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)miR-149，miR-NC組和miR-149組的miR-149相對表達(dá)量分別為（1.042±0.021）和（5.462±0.105），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.031，P=0.010）（見圖 3）。細(xì)胞劃痕愈合結(jié)果顯示，miR-NC組和miR-149組劃痕剩余距離百分比分別為（46.414±5.561）%和（78.083±7.133）%，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.119，P=0.024），過表達(dá) miR-149能抑制NCI-H226細(xì)胞遷移（見圖4）。Transwell小室結(jié)果表明，miR-NC組和miR-149組侵襲細(xì)胞分別為（462.546±8.475） 和（37.194±7.281） 個， 經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.247，P=0.019），過表達(dá)miR-149能抑制NCI-H226細(xì)胞侵襲（見圖5）。

圖2 miR-149在肺上皮細(xì)胞和LSCC細(xì)胞中的表達(dá)水平比較 （±s）

圖3 兩組miR-149相對表達(dá)量比較 （±s）

2.3 miR-149靶向下調(diào)NCI-H226細(xì)胞內(nèi)FOXM1的表達(dá)

通過對TARGETSCAN及MIRANDA等生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫的檢索發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子FOXM1可能是miR-149的下游潛在作用靶點(diǎn)之一。為驗(yàn)證這一假設(shè)，筆者檢測了過表達(dá)miR-149的NCI-H226細(xì)胞中FOXM1的表達(dá)變化。miR-NC組和miR-149組NCI-H226細(xì)胞內(nèi)FOXM1 mRNA的相對表達(dá)量分別為（1.043±0.074）和（0.434±0.051），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.083，P=0.032），過表達(dá)miR-149能夠下調(diào)NCI-H226細(xì)胞內(nèi)FOXM1 mRNA的表達(dá)水平（見圖6）。miR-NC組和miR-149組NCI-H226細(xì)胞內(nèi)FOXM1蛋白的相對表達(dá)量分別為（0.803±0.116）和（0.423±0.065），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.064，P=0.037），過表達(dá)miR-149能夠下調(diào)NCI-H226細(xì)胞內(nèi)FOXM1蛋白的表達(dá)（見圖7）。同時，對細(xì)胞遷移和侵襲具有重要促進(jìn)作用的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2，miR-NC組和miR-149組中MMP-2 mRNA的相對表達(dá)量分別為（1.153±0.141） 和（0.412±0.059）， 經(jīng)t檢 驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.310，P=0.021）（見圖 8）。miR-NC組和miR-149組中MMP-2蛋白的相對表達(dá) 量 分 別 為（0.760±0.111） 和（0.432±0.109），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.303，P=0.026）（見圖9）。

圖4 miR-149對LSCC細(xì)胞遷移的影響

圖5 miR-149對LSCC細(xì)胞侵襲的影響

圖 6 兩組 FOXM1 mRNA比較 （±s）

圖7 兩組FOXM1蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

圖 8 兩組 MMP-2 mRNA比較 （±s）

圖9 兩組MMP-2蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

3 討論

miR-149編碼基因位于人類染色體2q37.3上[5]。miR-149在生理和病理生理過程中發(fā)揮重要作用。例如，在骨關(guān)節(jié)炎患者的軟骨細(xì)胞中檢測到miR-149的表達(dá)下調(diào)，并且與炎癥調(diào)節(jié)因子白介素6的表達(dá)升高有關(guān)，提示miR-149在炎癥發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[6]。除此之外，由吸煙導(dǎo)致的慢性阻塞性肺病細(xì)胞中IL-1β和TNF-α的過度分泌也被證實(shí)與miR-149表達(dá)下調(diào)相關(guān)[7]。近年來對miR-149功能的研究多集中于腫瘤學(xué)領(lǐng)域，在腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌、前列腺癌及胃癌中均發(fā)現(xiàn)miR-149的表達(dá)下調(diào)[8-11]。

在本研究中，筆者通過對LSCC及癌旁組織的檢測發(fā)現(xiàn)，miR-149在LSCC中的表達(dá)明顯降低，并且與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)，提示miR-149可能通過抑制LSCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移而抑制腫瘤發(fā)展。為此，筆者通過在LSCC的NCI-H226細(xì)胞中過表達(dá)miR-149并借助劃痕愈合實(shí)驗(yàn)及Transwell小室實(shí)驗(yàn)證明miR-149能夠抑制NCI-H226細(xì)胞的遷移和侵襲能力。為探討miR-149的作用機(jī)制，筆者通過生物信息學(xué)檢索發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXM1可能是miR-149的作用靶點(diǎn)之一。FOXM1已在包括肺癌在內(nèi)的多種人類惡性腫瘤中被證明具有促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[12-13]。筆者通過qRT-PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)miR-149負(fù)向調(diào)控FOXM1的表達(dá)。并且，F(xiàn)OXM1轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)MMP-2的表達(dá)水平也受到抑制。MMP-2是一種被廣泛認(rèn)可的參與分解細(xì)胞外機(jī)制而促進(jìn)細(xì)胞遷移侵襲的基質(zhì)金屬蛋白酶，其表達(dá)改變從分子水平解釋了過表達(dá)miR-149后細(xì)胞遷移及侵襲能力變化的原因[14]。

綜上所述，miR-149在LSCC中表達(dá)下調(diào)并與腫瘤轉(zhuǎn)移表型關(guān)系密切。在體外，miR-149夠通過抑制FOXM1/MMP-2信號通路的表達(dá)來抑制LSCC細(xì)胞的遷移和侵襲能力，最終抑制腫瘤進(jìn)展。