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        胸水細(xì)胞蠟塊在肺癌診斷和EGFR基因檢測(cè)中的應(yīng)用研究*

        2018-10-18 09:03:22陳一峰陳婷陳瑋姍姚錫虎張坤河李輝蘇春陽(yáng)
        關(guān)鍵詞:蠟塊胸水組織化學(xué)

        陳一峰,陳婷,陳瑋姍,姚錫虎,張坤河,李輝,蘇春陽(yáng)

        (福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院 病理科,福建 泉州 362000)

        一項(xiàng)權(quán)威大規(guī)模統(tǒng)計(jì)表明,肺癌在中國(guó)的發(fā)病率和死亡率最高,老年人(>60歲)是高發(fā)人群[1]。>50%肺癌患者出現(xiàn)胸腔積液,約15%肺癌患者被確診時(shí)已有胸腔積液[2],轉(zhuǎn)移性肺腺癌是引起晚期肺癌伴胸腔積液最常見(jiàn)的病因,伴有惡性胸水的肺癌患者已失去手術(shù)治療機(jī)會(huì),表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinaseinhibitors,EGFR-TKIs)靶向用藥為其首選治療方案。本科室常規(guī)開(kāi)展細(xì)胞學(xué)涂片、細(xì)胞蠟塊聯(lián)合免疫組織化學(xué)染色檢查明確肺腺癌的診斷,而后檢測(cè)肺腺癌細(xì)胞蠟塊標(biāo)本的表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermalgrowth factor receptor,EGFR)基因的突變情況,并與同期活檢或手術(shù)的肺腺癌組織塊的EGFR基因突變情況進(jìn)行對(duì)比,現(xiàn)報(bào)道如下。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        選取2016年1月-2017年6月福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院病理科歸檔保存的胸水常規(guī)涂片和細(xì)胞蠟塊切片292例,胸水均為臨床經(jīng)胸腔穿刺現(xiàn)抽即送(非胸腔引流裝置留存)的標(biāo)本,細(xì)胞蠟塊切片均有對(duì)應(yīng)的相關(guān)免疫組織化學(xué)染色。其中,男性190例,女性102例;年齡39~84歲,中位數(shù)年齡65歲。

        1.2 方法

        1.2.1 細(xì)胞蠟塊制備 取胸水100~150 ml置于2、3管50 ml錐形試管內(nèi),2 000 r/min離心10 min,棄上清液。常規(guī)細(xì)胞學(xué)涂片后,加入10%中性甲醛,2 000 r/min離心5 min,固定>3 h。待試管底部沉渣質(zhì)地變硬,用一次性竹簽小心刮取沉淀物于包埋紙,與組織塊一起固定、脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining, HE)染色。

        1.2.2 免疫組織化學(xué)法 用自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色儀染色(瑞士,Roche Benchmark XT),DAB顯色,中性樹(shù)膠封片,光鏡下觀察切片。所有抗體購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)有限公司,常規(guī)設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照。根據(jù)細(xì)胞學(xué)涂片和細(xì)胞蠟塊切片,針對(duì)性地選擇一抗,參考臨床病史縮小抗體范圍。常規(guī)選擇TTF-1、NapsinA抗體;懷疑消化系統(tǒng)源性轉(zhuǎn)移性腺癌,加選CDX2、CK20、CK7、Villin;懷疑乳腺源性,加選ER、PR、GATA3、GCDFP15;懷疑卵巢、輸卵管、子宮源性,加選pax8、Vim、WT1、CA125;選擇CR、MC、D2-40、BerEP4、Desmin標(biāo)記區(qū)分腺癌或增生間皮細(xì)胞;懷疑小細(xì)胞癌,加選CgA、Syn、CD56。TTF-1、CDX-2、ER、PR、GATA3、pax8、WT1均為細(xì)胞核著色;NapsinA、Villin、GCDFP15、Vim、CA125、MC、D2-40、Desmin、ALK、CgA、Syn 均為細(xì)胞質(zhì)著色;BerEP4、CD56為細(xì)胞膜著色;CR為細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)著色;CK7、CK20為細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)著色。

        1.2.3EGFR基因突變檢測(cè) DNA石蠟組織切片提取試劑盒(離心柱型)及EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)ǎ┵?gòu)自北京鑫諾美迪基因檢測(cè)技術(shù)有限公司。細(xì)胞蠟塊切片組織DNA的提取和樣品經(jīng)驗(yàn)證符合要求后,采用擴(kuò)增阻遏突變系統(tǒng)(amplification refractory mutation system, ARMS)-實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR), 應(yīng) 用 Stratagene Mx3000P qRTPCR 儀檢測(cè)EGFR外顯子 18、19、20、21(Exon18-21)29種常見(jiàn)形式的突變,19Del、L858R通過(guò)ARMS法擴(kuò)增。見(jiàn)圖1、2。

        圖1 EGFR基因19Del點(diǎn)突變擴(kuò)增圖

        圖2 EGFR基因Exon21 L858R點(diǎn)突變擴(kuò)增圖

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        數(shù)據(jù)分析采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率(%)表示,比較用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 細(xì)胞學(xué)涂片與細(xì)胞蠟塊切片結(jié)合免疫組織化學(xué)染色的病理診斷比較

        292例患者胸水行常規(guī)涂片檢查,查見(jiàn)癌細(xì)胞,即陽(yáng)性139例;未查見(jiàn)癌細(xì)胞,即陰性86例;查見(jiàn)異型或疑癌細(xì)胞,即不確定67例。292例患者胸水細(xì)胞蠟塊結(jié)合免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,陽(yáng)性175例,陰性114例,不確定3例。兩種方法檢出率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=75.861,P=0.000),后者陽(yáng)性檢出率高于前者,且不確定構(gòu)成比低于前者。

        175例細(xì)胞蠟塊查見(jiàn)癌細(xì)胞,呈單個(gè)、簇狀、腺管狀排列(見(jiàn)圖3),可見(jiàn)炎癥及纖維素性背景(見(jiàn)圖4),其中TTF-1、NapsinA陽(yáng)性,支持肺腺癌者166例;呈實(shí)性巢狀排列,相關(guān)神經(jīng)內(nèi)分泌酶標(biāo)陽(yáng)性(見(jiàn)圖5),支持小細(xì)胞癌者3例;其中ER、PR、GATA3(見(jiàn)圖6)、GCDFP15陽(yáng)性,支持乳腺癌者5例;其中pax8、Vim、WT1、CA125陽(yáng)性,支持卵巢癌者1例。3例因可供診斷的細(xì)胞過(guò)少,而歸入不確定者。

        圖3 癌細(xì)胞呈單個(gè)、簇狀、腺管狀排列 (×200)

        圖4 炎癥及纖維素性背景中的癌細(xì)胞 (×200)

        圖5 癌細(xì)胞CD56陽(yáng)性 (×200)

        圖6 癌細(xì)胞GATA3陽(yáng)性 (×200)

        2.2 細(xì)胞蠟塊與組織塊的EGFR基因突變檢測(cè)結(jié)果比較

        EGFR無(wú)任何突變定義為野生型,即EGFR陰性;有任意突變類(lèi)型的定義為突變型,即EGFR陽(yáng)性。175例細(xì)胞蠟塊中,EGFR陽(yáng)性84例,陽(yáng)性率為48%,其中女性54例,男性30例。同期檢測(cè)305例活檢或手術(shù)切除標(biāo)本組織塊的EGFR基因突變情況,EGFR陽(yáng)性131例,陽(yáng)性率為42.95%,其中女性80例,男性51例。用細(xì)胞蠟塊與組織塊檢測(cè)EGFR基因突變的陽(yáng)性率及男女構(gòu)成比比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.146和 0.226,P=0.284和 0.635)。

        3 討論

        胸水標(biāo)本在病理科甚是常見(jiàn),肺癌是引發(fā)胸水的主要病因之一,為明確診斷和后續(xù)精準(zhǔn)治療的需要,收集和保存好胸水中有限的細(xì)胞尤為重要。本科將臨床送檢“新鮮”的胸水沉渣石蠟包埋,制成細(xì)胞蠟塊,結(jié)果顯示細(xì)胞蠟塊結(jié)合免疫組織化學(xué)染色的陽(yáng)性檢出率高于細(xì)胞涂片,且不確定構(gòu)成比低于細(xì)胞涂片,說(shuō)明單憑傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)涂片檢查診斷腫瘤存在缺陷。本實(shí)驗(yàn)對(duì)67例細(xì)胞學(xué)涂片診斷不確定者進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),普遍的現(xiàn)象是可供診斷的瘤細(xì)胞數(shù)量比較少,加上分化好的癌細(xì)胞與增生間皮難以分辨,造成診斷者的憂(yōu)慮,而出現(xiàn)異型、疑癌細(xì)胞的報(bào)告內(nèi)容。細(xì)胞蠟塊HE切片中細(xì)胞的分布保留與實(shí)體組織類(lèi)似的排列結(jié)構(gòu),可提高診斷的準(zhǔn)確性。而且細(xì)胞蠟塊的連續(xù)切片可應(yīng)用于免疫組織化學(xué)染色,為腫瘤分型提供客觀依據(jù),有利于提示臨床確定相關(guān)部位的原發(fā)灶,正如本實(shí)驗(yàn)結(jié)合細(xì)胞形態(tài)與免疫組織化學(xué)結(jié)果,再根據(jù)臨床病史、陽(yáng)性體征,先后診斷了小細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)移性乳腺癌、卵巢癌。國(guó)外學(xué)者UGURLUOGLU[3]和MIYOSHI[4]等也強(qiáng)調(diào)細(xì)胞蠟塊的診斷價(jià)值。并且有研究指出,細(xì)胞蠟塊是晚期非小細(xì)胞肺癌ALK檢測(cè)的良好替代物[5]。

        EGFR是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化,抑制細(xì)胞凋亡的跨膜蛋白,在非小細(xì)胞肺癌患者中檢測(cè)EGFR基因的突變狀態(tài)具有重要的臨床意義,是決定患者是否能夠應(yīng)用EGFR-TKIs治療的先決條件[6]。ARMS法利用特異性引物選擇性的擴(kuò)增突變基因,而熒光探針在Taq酶的作用下水解釋放熒光,在qRT-PCR儀平臺(tái)上進(jìn)行DNA樣本的基因突變檢測(cè),ARMS法比直接測(cè)序法更加敏感,可檢測(cè)樣本中低至1%的突變,更適用于腫瘤含量較少的標(biāo)本檢測(cè)[7]。本實(shí)驗(yàn)采用ARMS法分別檢測(cè)胸水細(xì)胞蠟塊和同期活檢或手術(shù)標(biāo)本組織塊的EGFR基因突變情況,發(fā)現(xiàn)用細(xì)胞蠟塊與組織塊檢測(cè)EGFR基因突變的陽(yáng)性率及男女構(gòu)成比無(wú)差異,2種樣本的檢測(cè)效果相當(dāng),本研究中19和21號(hào)外顯子的突變檢出率達(dá)95%左右,與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[8-9]。

        按照細(xì)胞學(xué)涂片診斷癌→結(jié)合細(xì)胞蠟塊形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)結(jié)果診斷為肺腺癌→ARMS-qPCR法檢測(cè)EGFR基因突變的流程處理肺癌胸水標(biāo)本,確實(shí)行之有效、值得推廣。細(xì)胞蠟塊一方面有助于明確診斷腫瘤的類(lèi)型、來(lái)源,另一方面可成為DNA提取的樣品來(lái)源,國(guó)內(nèi)已有用HRM方法檢測(cè)胸水腺癌細(xì)胞蠟塊EGFR基因突變的可行性研究[10]。伴有癌性胸水的晚期肺癌患者,腫瘤實(shí)體活檢組織往往難以獲取,此時(shí)細(xì)胞蠟塊可用于相關(guān)驅(qū)動(dòng)基因的檢測(cè),有利于臨床篩選靶向用藥適用患者及判斷耐藥機(jī)制,從而更好地為患者制定個(gè)體化治療方案。

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