吳昆鵬，陳瑩，游曉星，黃治家，言彩紅

（1.南華大學附屬第二醫(yī)院 重癥醫(yī)學科，湖南 衡陽421001；2.南華大學附屬第二醫(yī)院麻醉科，湖南 衡陽421001；3.南華大學 微生物研究所，湖南 衡陽 421001）

腸功能損傷是膿毒血癥的一個關鍵特征。目前研究表明，小腸在膿毒血癥的病理生理過程中起中心作用，并且稱為全身性炎癥反應的始動因素[1]。重癥患者常見腸道屏障功能紊亂及其引起的細菌易位，其在膿毒血癥的發(fā)病機制中起重要作用[2-3]。此外，研究表明，危重疾病進展為多器官功能障礙綜合征與腸道通透性增加有關[4]。如何預防或改善炎癥性腸道屏障功能障礙是膿毒血癥基礎和臨床研究的重要方向。燕麥β-葡聚糖（oat β-glucan, Oglu）對腸道功能的保護作用已得到廣泛認可，本研究將其引入膿毒血癥動物模型，觀察Oglu是否可以減輕膿毒血癥大鼠的小腸損傷，并探索其潛在的作用機制

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

50只SD雄性大鼠，8周齡，體重250～300 g，實驗前禁食24 h，飲水不限。由南華大學實驗動物部提供[許可證號：SYXK（湘）2015～0001]。按隨機數(shù)字表法分為對照組（10只），膿毒血癥組（20只），Oglu組（20只）。實驗前均適應性喂養(yǎng)3 d。膿毒血癥組和Oglu組以改良盲腸結扎穿孔法（cecal ligation and puncture, CLP）復制膿毒血癥模型[5]。

1.2 主要試劑

Oglu（南通振華生物工程有限公司），細胞總蛋白提取試劑盒（美國Thermo Scientific公司），β-連環(huán)蛋白（β-catenin）多克隆抗體（ab6302）、基質金屬蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13, MMP-13）多克隆抗體（ab39012）、T細胞因子（T cell factor-4, TCF-4）多克隆抗體（ab130014）、低氧誘導因子 -1（hypoxia-inducible factor-1, HIF-1α）單克隆抗體（ab463）購自美國Abcam公司，RevertAidTMFirst strand cDNA Synthesis Kit（立陶宛Fermentas公司），Trizol（美國 Invitrogen公司），SYBGreen PCR Mix（瑞士Roche Applied Science公司），酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）試劑盒（上海Dakewe Biotech公司）。

1.3 CLP模型的復制

對照組未做任何處理，膿毒血癥組和Oglu組復制膿毒血癥模型。將大鼠用40 mg/kg水合氯醛麻醉，在腹壁切開2 cm腹中線切口以暴露盲腸，用18號針刺穿2次。通過穿刺傷口擠出少量的盲腸內容物后，封閉手術切口。給予0.9%無菌鹽水溶液，按24 ml/kg體重進行液體復蘇。參照文獻[6]，Oglu組采用中劑量高分子量Oglu（3%，1 000 mg/kg）。Oglu組大鼠經口灌胃Oglu溶液，膿毒血癥組和對照組大鼠喂養(yǎng)等量糖鹽水。

1.4 ELISA

在Oglu或糖鹽水灌胃后12和24 h收集全血。按照ELISA試劑盒說明書進行操作，測量血清白細胞介素 -6（Interleukin-6, IL-6）、腫瘤壞死因子 -α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）和降鈣素原（Procalcitonin,PCT）的濃度。

1.5 蘇木精-伊紅染色法

分別于實驗12和24 h各處死大鼠5只，手術切除空腸組織標本，固定、石蠟包埋，用蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining, HE）染色。在光學顯微鏡下觀察切片，空洞黏膜損傷的病理評分參照文獻[7]。盲法測定：0級，正常黏膜和絨毛；1級，上皮間隙增大，血管堵塞；2級，上皮間隙明顯擴大，上皮和固有層分離；3級，黏膜上皮和部分絨毛尖端剝落；4級，絨毛脫落，固有層和擴張血管暴露；5級，固有層顯示分解，出血和潰瘍。

1.6 PCR和Western blot檢測

采用Trizol提取小腸黏膜組織RNA，紫外分光光度計檢測RNA完整性及純度，以1μg總RNA為模板進行逆轉錄，生成cDNA，具體步驟參照Fermentas RNA逆轉錄試劑盒說明書。獲得的RNA置于-70℃冰箱備用。同時采用RIPA裂解液提取小腸組織總蛋白。用PCR、Western blot檢測各組小腸組織中HIF-1α、β-catenin、TCF-4、MMP-13表達的變化。HIF-1α引物序列：5′-CTGGATGCTGGTGATTTAG AGTTCAAACTGAGTCAATCCCA-3′；β-catenin引物序列：5′-ATGGGTAGGGCAAATCAGTAAGAGGTA AGCATCGTATCACAGCAGGTTAC-3′；TCF-4引物序列：5′ -CGAGTGCACGTTGAAAGAAAATGTGAAGCT GTCGCTCCTT-3′；MMP-13引物序列：5′-GCCTTC CTCTTCTTGAGCTGTTGGACCACTTGAGAGTTCG-3′；β-actin引物序列：5′-GATATCGCCGCGCTCGTCG TCGGCTGGGGTGTTGAAGGTCTC-3′。取蛋白樣品與上樣緩沖液混合煮沸變性，電泳分離，轉至聚偏氟乙烯膜，室溫下加入脫脂奶粉封閉，分別加入HIF-1α單克隆抗體、β-catenin多克隆抗體、TCF4多克隆抗體、MMP-13多克隆抗體，室溫下孵育過夜，在ECL化學發(fā)光檢測系統(tǒng)上顯影。所有實驗程序經南華大學動物倫理委員會批準。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SSPS 21.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠小腸黏膜病理學變化

不同時間的病理學檢查結果顯示，對照組均無腸黏膜損傷（見圖1A、B）。然而，膿毒血癥組上皮細胞間隙增大，絨毛上皮細胞和隱窩細胞數(shù)量減少，絨毛上皮排列紊亂，部分絨毛尖端溢出（見圖1C、D）。相比之下，Oglu組上皮細胞間隙僅在少數(shù)區(qū)域擴大，隱窩上皮細胞豐富（見圖1E、F）。

圖1 各組大鼠不同時間的空腸組織病理學變化 （HE×100）

2.2 各組血清PCT、IL-6及TNF-α水平

對照組12h與24 h的血清PCT、IL-6及TNF-α水平比較，經t檢驗，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。對照組、膿毒血癥組、Oglu組12和24 h血清PCT水平比較，經單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=143.967和 101.891， 均P=0.000）。3組 12和24 h血清IL-6水平比較，經單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=176.123和164.105，均P=0.000）。3組12和24 h血清TNF-α水平比較，經單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=499.941和217.978，均P=0.000）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，膿毒血癥組12和24 h血清PCT、IL-6及TNF-α水平高于其他組（P＜0.05）。見表1和圖2。

2.3 各組大鼠腸損傷評分比較

對照組、膿毒血癥組、Oglu組大鼠12和24 h腸損傷評分比較，經單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，12 h時，膿毒血癥組和Oglu組腸損傷評分高于對照組（P＜0.05）；24 h時，膿毒血癥組腸損傷評分高于Oglu組和對照組（P＜0.05）。見表2和圖3。

2.4 Oglu對膿毒血癥大鼠HIF-1α表達的影響

對照組、膿毒血癥組、Oglu組大鼠腸黏膜組織中HIF-1α mRNA和蛋白表達水平比較，經單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，Oglu組HIF-1α mRNA和蛋白表達水平高于對照組和膿毒血癥組（P＜0.05）。見表3和圖4。

表1 各組大鼠不同時間血清PCT、IL-6及TNF-α水平比較（n =5，±s）

表1 各組大鼠不同時間血清PCT、IL-6及TNF-α水平比較（n =5，±s）

組別 PCT/（ng/ml） IL-6/（ng/L） TNF-α/(μg/L)對照組12 h 8.28±0.47 23.74±1.25 17.98±1.13 24 h 8.28±0.47 23.74±1.25 17.98±1.13 t值 0.000 0.000 0.000 P值 1.000 1.000 1.000膿毒癥組12 h 31.50±3.46 63.98±5.98 79.58±5.46 24 h 29.54±3.83 77.50±7.75 85.58±9.06 t值 0.526 0.837 3.174 P值 0.489 0.387 0.113組別 PCT/（ng/ml） IL-6/（ng/L） TNF-α/(μg/L)Oglu組12 h 20.50±1.37 56.60±1.34 70.42±1.45 24 h 19.16±1.33 64.52±3.21 75.26±2.82 t值 0.035 7.190 2.707 P值 0.857 0.028 0.139

圖2 各組大鼠不同時間的血清炎癥指標比較 （n =5，±s）

表2 各組大鼠不同時間腸損傷評分比較（n =5，分，±s）

表2 各組大鼠不同時間腸損傷評分比較（n =5，分，±s）

組別 12 h腸損傷評分 24 h腸損傷評分 t值 P值對照組 0.20±0.01 0.30±0.02 0.030 0.868膿毒血癥組 1.74±0.39 2.88±0.57 0.503 0.498 Oglu組 1.24±0.38 1.50±0.48 0.122 0.736 F值 30.826 45.412 P值 0.000 0.000

圖3 各組大鼠不同時間的腸損傷評分比較 （n =5，±s）

表3 各組大鼠腸黏膜組織中HIF-1α mRNA和蛋白表達水平比較 （±s）

表3 各組大鼠腸黏膜組織中HIF-1α mRNA和蛋白表達水平比較 （±s）

注：?與Oglu組比較，P ＜0.05

組別 HIF-1α mRNA HIF-1α蛋白對照組（n =10） 0.900±0.100? 0.112±0.013?膿毒血癥組（n =20） 1.240±0.305? 0.232±0.024?Oglu組（n =20） 2.940±0.568 0.436±0.059 F值 42.061 94.258 P值 0.000 0.000

圖4 各組大鼠腸黏膜組織中HIF-1α蛋白的表達

2.5 實驗前后各組Wnt/β-catenin信號通路相關分子的表達

2.5.1 β-catenin 對照組、膿毒血癥組、Oglu組大鼠腸黏膜組織中β-catenin mRNA和蛋白表達水平比較，經單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，膿毒血癥組β-catenin mRNA和蛋白表達水平高于對照組和Oglu組（P＜0.05）。見表 4和圖 5。

表4 各組大鼠腸黏膜組織中β-catenin mRNA和蛋白表達水平比較 （±s）

表4 各組大鼠腸黏膜組織中β-catenin mRNA和蛋白表達水平比較 （±s）

注：?與Oglu組比較，P ＜0.05

組別 β-catenin mRNA β-catenin蛋白對照組（n =10） 0.060±0.012? 1.080±0.130?膿毒血癥組（n =20） 0.291±0.052 3.140±0.643 Oglu組（n =20） 0.124±0.018? 1.960±0.114?F值 67.659 36.176 P值 0.000 0.000

圖5 各組大鼠腸黏膜組織中β-catenin蛋白的表達

2.5.2 TCF-4 Wnt/β-catenin信號通路激活后，可進一步活化核轉錄因子TCF-4。對照組、膿毒血癥組、Oglu組大鼠腸黏膜組織中TCF-4 mRNA和蛋白表達水平比較，經單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，膿毒血癥組TCF-4 mRNA和蛋白表達水平高于對照組和Oglu組（P＜0.05）。見表 5和圖 6。

表5 各組大鼠腸黏膜組織中TCF-4 mRNA和蛋白表達水平比較 （±s）

表5 各組大鼠腸黏膜組織中TCF-4 mRNA和蛋白表達水平比較 （±s）

注：?與膿毒血癥組比較，P ＜0.05

組別 TCF-4 mRNA TCF-4蛋白對照組（n =10） 0.001±0.001? 1.068±0.094?膿毒血癥組（n =20） 0.105±0.082 2.880±0.630 Oglu組（n =20） 0.010±0.003? 1.980±0.259?F值 7.371 26.036 P值 0.008 0.000

圖6 各組大鼠腸黏膜組織中TCF-4蛋白的表達

2.5.3 MMP-13 對照組、膿毒血癥組、Oglu組大鼠腸黏膜組織中MMP-13 mRNA和蛋白表達水平比較，經單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，膿毒血癥組MMP-13 mRNA和蛋白表達水平高于對照組和Oglu組（P＜0.05）。見表 6和圖 7。

表6 各組大鼠腸黏膜組織中MMP-13 mRNA和蛋白表達水平比較 （±s）

表6 各組大鼠腸黏膜組織中MMP-13 mRNA和蛋白表達水平比較 （±s）

注：?與膿毒血癥組比較，P ＜0.05

組別 MMP-13 mRNA MMP-13蛋白對照組（n =10） 0.100±0.016? 1.020±0.084?膿毒血癥組（n =20） 0.530±0.050 2.720±0.349 Oglu組（n =20） 0.318±0.019? 1.820±0.084?F值 222.25 79.779 P值 0.000 0.000

圖7 各組大鼠腸黏膜組織中MMP-13蛋白的表達

3 討論

日常生活中，燕麥對人體有很好的保健作用，對胃腸道有調節(jié)保護作用，但具體作用機制并不清楚。本研究采用燕麥中的主要有效成分β-葡聚糖進行實驗，探索其保護腸道的作用機制。首先，本研究觀察到Oglu能減輕膿毒血癥誘導的空腸病理改變，抑制炎癥反應，如膿毒血癥模型大鼠中血清PCT、IL-6及TNF-α水平降低。進一步探索Oglu保護空腸的分子機制，結果表明Oglu對炎癥細胞因子的抑制作用可能與上調HIF-1α表達，并調控Wnt/β-catenin信號通路有關。

HIF-1α是人體組織中廣泛表達的轉錄因子，常氧環(huán)境下在胞漿內表達，但極不穩(wěn)定，很快降解（約5 min）。而在低氧環(huán)境下可抑制HIF-1α降解，從而引起其在胞內積聚并轉位至胞核，在胞核內與HIF-1β形成二聚體，發(fā)揮轉錄活性，最終激活下游各種與細胞增殖分化相關的基因的轉錄[8]?；A研究證實，HIF-1α是低氧環(huán)境中起細胞調控作用的關鍵基因，HIF-1α在細胞中表達增加可能對低氧誘導的病理生理過程產生積極影響，對缺血性疾病是有利的[9-11]。低氧能調節(jié)多信號途徑，增加自我更新，同時減少基質MIAMI細胞的分化，減少細胞衰老和凋亡，這是人體在缺氧條件下自我修復的能力，HIF-1α表達上調就是這其中極為重要的一環(huán)[12]。膿毒血癥早期血流動力學改變，導致血流重新分布，同時動靜脈分流，胃腸黏膜血流減少，腸道缺血再灌注，腸黏膜屏障受損，是啟動MODS的重要因素[13-15]。低氧刺激，膿毒血癥腸黏膜中HIF-1α表達上調，繼而引起有效的抗炎作用，在降低氧利用度的條件下限制組織損傷[16]。本研究結果表明，膿毒血癥組小腸組織中HIF-1α水平較對照組表達升高，使用Oglu后，膿毒血癥大鼠小腸組織中HIF-1α水平進一步升高，與對照組和膿毒血癥組有差異。結果表明，Oglu能促進低氧時腸黏膜細胞合成HIF-1α，其對HIF-1α的調控作用，可能是其發(fā)揮腸道抗缺血缺氧作用的關鍵機制之一。

Wnt通路是決定胚胎發(fā)育過程和成體組織細胞命運的基本信號機制之一。在腸上皮中，該途徑調節(jié)腸干細胞的增殖。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Wnt通路在成體腸細胞的自我更新和分化中起關鍵作用[17-18]。Wnt/β-catenin信號通路主要包括Wnt蛋白家族、β-連環(huán)蛋白及相關抑制因子，所謂經典Wnt信號傳導的關鍵分子是β-連環(huán)蛋白[19]。許多研究顯示，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導參與腸發(fā)育和組織代謝，包括β-連環(huán)蛋白或Tcf4基因的遺傳消融或擴散性細胞外Wnt信號傳導抑制劑的產生[20]。Wnt拮抗劑Dickkopf-1（Dkk1）在腸上皮中的轉基因表達影響小腸中的增殖和隱窩-絨毛組織，由腺病毒遞送介導的Dkk1系統(tǒng)表達誘導小腸和結腸的快速變性[21-22]。Wnt/β-catenin是機體內一條非常保守的信號通路，啟動因子是Wnt蛋白，在無Wnt蛋白啟動因子刺激時，β-catenin與APC、GSK-3β、Axin等組成復合體，β-catenin被磷酸化降解，因此無法啟動所調控的靶基因轉錄。當胞外信號激活Wnt時，Wnt蛋白和與跨膜受體卷曲蛋白的胞外區(qū)結合，導致Axin-GSK3β-APC-β-catenin復合體瓦解，β-catenin在細胞質中增多，依靠濃度梯度改變，進入核內與T細胞因子/淋巴增強因子結合，導致Wnt靶基因的表達，啟動下游靶基因的轉錄，影響細胞的增值、分化、代謝及凋亡[23]。因此，β-catenin和TCF-4是Wnt/β-catenin信號通路中的關鍵分子。Wnt/β-catenin通路過度激活可使小腸上皮細胞過度分化、成熟加速，同時也導致蛋白酶表達異常，而加速細胞外基質降解，最終引起腸道功能紊亂甚至癌變[24]。本研究也發(fā)現(xiàn)，對照組和Oglu組大鼠小腸組織中β-catenin、TCF-4 mRNA和蛋白表達水平較低，而膿毒血癥組β-catenin、TCF-4 mRNA和蛋白表達水平較高，表明Oglu可能通過下調Wnt/β-catenin/TCF-4通路，發(fā)揮對膿毒血癥小腸損傷的保護作用。MMP-13是Wnt/β-catenin信號通路下游參與細胞外基質代謝的重要分子[25]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，膿毒血癥組MMP-13 mRNA和蛋白表達水平較高，對照組和Oglu組大鼠小腸組織中MMP-13表達水平較低，這與β-catenin和TCF-4的表達趨勢一致，提示Oglu通過調控Wnt/β-catenin信號通路，發(fā)揮腸道保護作用。

綜上所述，本研究結果初步表明，膿毒血癥大鼠小腸損傷有HIF-1α和Wnt/β-catenin/TCF信號通路參與，低氧狀態(tài)下Oglu對HIF-1α的合成有促進作用，對Wnt/β-catenin信號通路有一定的抑制作用，從而發(fā)揮對小腸保護作用。但依然存在許多問題需要進一步闡明，如Oglu對HIF-1α的調節(jié)是否僅限于促進合成，是否對HIF-1α的氧依賴蛋白降解過程也有影響，Oglu對Wnt/β-catenin信號通路的其他靶基因的調節(jié)情況如何？這些還有待進一步研究。