牛東生

多項研究報道，食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)已由全球惡性腫瘤第8位上升至第7位，且有著極高的死亡率[1]。隨著醫(yī)療研究對ESCC生物機(jī)制及分子研究的不斷深入，ESCC相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)發(fā)生機(jī)制亦有重大突破，如Kim等[2]證實TOPA2表達(dá)與腫瘤細(xì)胞凋亡有著密切關(guān)聯(lián)，研究亦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂周期蛋白20(CDC20)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤性；有絲分裂監(jiān)管相關(guān)激酶2(NEK2)在腫瘤的終末階段病理組織中被證實大量表達(dá)[3]。本文從腫瘤細(xì)胞增殖，腫瘤細(xì)胞分裂及腫瘤標(biāo)志物臨床應(yīng)用研究等角度探討食管鱗癌的發(fā)病機(jī)制，并探析CDC20、TOP2A、NEK2與ESCC轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取本院2012年5月至2015年5月收治且成功實施根治性手術(shù)的食管鱗癌患者70例，均經(jīng)病理組織學(xué)診斷，符合食管鱗癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。新鮮組織標(biāo)本均在食管鱗癌根治術(shù)中切取，A組(癌組織)，B組(癌旁組織)，C組(正常組織)。全部患者中有48例男性、22例女性；年齡<60歲者40例、≥60歲者30例；按瘤體大小分為41例<5 cm、29例≥5 cm；按腫瘤病灶位置分為37例上段、33例中、下段；按TNM分期為11例Ⅰ期、31例Ⅱ期、17例Ⅲ期、11例Ⅳ期；按腫瘤分化程度分為37例中-高分化、33例低分化；按淋巴轉(zhuǎn)移情況分為28例淋巴轉(zhuǎn)移、42例無淋巴轉(zhuǎn)移；按靜脈浸潤情況分為29例靜脈浸潤、41例無靜脈浸潤。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前未開展放化療干預(yù)；②符合手術(shù)切除指征；③病例資料齊全；④知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有嚴(yán)重并發(fā)癥；②術(shù)前已接受放化療；③病例資料不全；④隨訪調(diào)查失聯(lián)者。

1.2 方法

所有標(biāo)本均常規(guī)甲醛(10%)固定4～6 h，梯度脫水，組織浸蠟，石蠟包埋，切片；免疫組化S-P法進(jìn)行染色，應(yīng)用奧林巴斯BX51型顯微鏡閱片，輔助Image pro plus 5.0圖像處理軟件觀察CDC20、TOP2A、NEK2在食管鱗癌中的表達(dá)灰度值。結(jié)果判定：2名病理醫(yī)師雙盲法狀態(tài)下，高倍鏡(×400)觀察腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒判為陽性細(xì)胞。每份標(biāo)本隨機(jī)選擇5個視野，每個視野下計數(shù)100個腫瘤細(xì)胞，共計500個，計算陽性細(xì)胞所占百分比。陽性細(xì)胞率≥10%判斷為陽性，陽性細(xì)胞率<10%判斷為陰性。半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測病理組織內(nèi)CDC20、TOP2A、NEK2表達(dá)情況，依據(jù)Trizol RNA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)方案作基因RNA提取，DEPC備制，再行瓊脂糖凝膠電泳鑒定 mRNA完整性。即選用實用ABI7500型實時定量PCR儀做標(biāo)本基因擴(kuò)增，經(jīng) UVIpro紫外凝膠成像及分析系統(tǒng)觀察、掃描、拍照，分析圖片中的CDC20、TOP2A、NEK2與β-actin表達(dá)強(qiáng)度，2-△△Ct算法計算相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)納入SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析，計數(shù)χ2比較，計量t檢驗，Kaplan-Meier法評估預(yù)后OS、PFS，Log-rank分析相關(guān)因素，多因素生存分析采用Cox比例風(fēng)險模型，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗狀細(xì)胞癌組織鏡下CDC20、TOP2A、NEK2表達(dá)特征

S-P 法檢測觀察，癌細(xì)胞可呈癌巢狀分布，伴有不規(guī)則細(xì)胞列，細(xì)胞異型，核分裂狀，可見于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，陽性染色顆粒明顯。

2.2 不同食管組織標(biāo)本中CDC20、TOP2A、NEK2表達(dá)分析

A組CDC20、TOP2A、NEK2表達(dá)水平最高，與B、C差異明顯(P<0.05)；B組CDC20、TOP2A、NEK2表達(dá)水平低于A組，高于C組，差異明顯(P<0.05)。見表1。

表1 不同食管組織標(biāo)本中CDC20、TOP2A、NEK2表達(dá)分析

注：a為與C組對比，P<0.05，b為與B組對比，P<0.05。

2.3 CDC20、TOP2A、NEK2表達(dá)與ESCC臨床病理特征關(guān)系分析

ESCC患者性別、年齡、瘤體大小、位置等因素與CDC20、TOP2A、NEK2表達(dá)無相關(guān)性(P>0.05)；TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移及浸潤因素與CDC20、TOP2A、NEK2陽性表達(dá)率呈正相關(guān)性(P<0.05)；腫瘤分化與CDC20、TOP2A、NEK2陽性表達(dá)率呈負(fù)相關(guān)；CDC20與TOP2A，CDC20與NEK2，TOP2A與NEK2表達(dá)均呈正相關(guān)性。見表2。

表2 CDC20、TOP2A、NEK2陽性表達(dá)與ESCC臨床病理特征關(guān)系分析(例，%)

2.4 CDC20、TOP2A、NEK2表達(dá)與ESCC患者預(yù)后相關(guān)性分析

所有病患術(shù)后均持續(xù)隨訪6個月～3年，采取Cox比例風(fēng)險模型將TNM分期、腫瘤分化、淋巴轉(zhuǎn)移、浸潤及CDC20、TOP2A、NEK2陽性表達(dá)做多因素分析，結(jié)果證實TNMⅢ～Ⅳ期、低分化腫瘤、淋巴轉(zhuǎn)移、靜脈浸潤及CDC20、TOP2A、NEK2陽性表達(dá)均是影響ESCC患者預(yù)后存活的危險因素。見表3。

表3 CDC20、TOP2A、NEK2表達(dá)與ESCC患者預(yù)后OS、PFS相關(guān)性分析

3 討論

ESCC病發(fā)是多因素、多步驟、多階段及多基因改變的過程，而細(xì)胞周期調(diào)控異常、細(xì)胞增殖失控是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制。對此眾多學(xué)者提出結(jié)合ESCC腫瘤增殖、浸潤的分子機(jī)制，探析符合ESCC診療的高敏感、特異性良好的診斷指標(biāo)來評估ESCC轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及預(yù)后變化。

CDC20屬細(xì)胞周期蛋白，亦是保證細(xì)胞有絲分裂正常進(jìn)行的關(guān)鍵蛋白，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂S期～G2/M期細(xì)胞染色體DNA完成分裂復(fù)制的關(guān)鍵，也是后期促進(jìn)復(fù)合體/周期體APC/C 的正調(diào)控子[5]。研究證實，CDC20出現(xiàn)異常表達(dá)可導(dǎo)致有絲分裂出錯,并能引起一些癌癥基因的過表達(dá)和抑癌基因的丟失或者突變[6]。樂祥陽[7]研究發(fā)現(xiàn)，CDC20表達(dá)異常能夠?qū)Π┘?xì)胞增殖形成促進(jìn)效應(yīng)，且提升癌細(xì)胞自我修復(fù)，引起腫瘤患者腫瘤抑制失控。另外有學(xué)者發(fā)現(xiàn)CDC20亦可減緩腫瘤細(xì)胞凋亡速度，對腫瘤的進(jìn)展均有參與[8]。對此有學(xué)者建議將CDC20作為腫瘤治療的新靶點。

新近研究指出ESCC與原癌基因的激活、抑癌基因的失活、調(diào)節(jié)DNA的修復(fù)及維持基因穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)蛋白的功能障礙等分子生物學(xué)因素密切相關(guān)[9]。TOP2A是一類細(xì)胞核內(nèi)數(shù)量僅次于組蛋白的蛋白酶之一，是控制和改變DNA的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)拓?fù)錉顟B(tài)以及影響DNA轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)控酶，均有調(diào)節(jié)染色體縮合、染色單體分離的功能[10]。研究表明TOPA2可以剪切DNA，形成TOP-DNA-AMPPNP復(fù)合體從而參與細(xì)胞有絲分裂。

NEK2是本地化的中心體，通過調(diào)控中心體正確地復(fù)制、分離、成熟最終建立雙極紡錘體。目前已有研究證實，NEK2在多種腫瘤如急性髓系白血病、前列腺癌、乳腺癌、胃癌及惡性膠質(zhì)瘤等組織中均呈現(xiàn)高表達(dá)，且其表達(dá)水平與組織的惡性進(jìn)程有關(guān)[11]。Fang等[12]通過人體細(xì)胞系研究指出，NEK2表達(dá)異?？稍斐芍行捏w結(jié)構(gòu)異常改變，導(dǎo)致功能性缺陷，而這類不穩(wěn)定因素將感染基因整體穩(wěn)定性，由此誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，聯(lián)級效應(yīng)參與腫瘤的轉(zhuǎn)移、浸潤。

本次研究中針對ESCC患者病理特征分別對不同組織樣本做S-P法染色，觀察并通過RT-PLR法做CDC20、TOP2A、NEK2基因表達(dá)檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ESCC癌組織內(nèi)CDC20、TOP2A、NEK2均呈高表達(dá)，與癌旁組織及正常組織相比呈梯度型遞增，各組差異明顯；且與TNM分期、腫瘤分化、淋巴轉(zhuǎn)移及浸潤因素呈正相關(guān)性。表明CDC20、TOP2A、NEK2與ESCC患者病理進(jìn)展、轉(zhuǎn)移有明顯關(guān)聯(lián)。另外，研究證實TNM Ⅲ～Ⅳ期、高分化腫瘤、淋巴轉(zhuǎn)移、靜脈浸潤是影響ESCC患者預(yù)后存活的危險因素，說明CDC20、TOP2A、NEK2異常表達(dá)可預(yù)示ESCC的侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，尤其當(dāng)TNM分期越嚴(yán)重，其指標(biāo)表達(dá)越高。通過CDC20、TOP2A、NEK2聯(lián)檢可對ESCC腫瘤惡化發(fā)展機(jī)制、腫瘤分期評估、分化程度等做輔助參考評估，提升ESCC臨床診療作用。研究指出，針對CDC20、TOP2A、NEK2表達(dá)對腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制做靶向抑制[13]，以RNA干擾技術(shù)進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)節(jié)，減少腫瘤細(xì)胞的增殖、進(jìn)展，為從基因水平治療食管鱗癌提供新的思路。

綜上所述，CDC20、TOP2A、NEK2高表達(dá)與食管鱗癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、預(yù)后均密切相關(guān)，三項指標(biāo)聯(lián)檢可準(zhǔn)確評估食管癌病理狀態(tài)，為患者預(yù)后判定提供參考。