涂 云

胃腫瘤是最常見的腫瘤之一，是目前已發(fā)現(xiàn)的世界上最致命的腫瘤[1-2]。我國是胃癌高發(fā)地區(qū)，人口基數(shù)大，胃癌患者數(shù)不勝數(shù)，因此在胃癌診治上，目前還是不能完全滿足患者的診治需求，胃癌治療面臨著巨大的挑戰(zhàn)[3]。雖然近些年來腫瘤的治療已經(jīng)取得一定的進(jìn)步，由于胃切除后局部復(fù)發(fā)率較高，對患者而言并非最佳治療方式[4]。除此之外，胃腫瘤的預(yù)后和診斷目前還是仍相對較差[5]。山柰揮發(fā)油是1種新型的廣譜抗癌藥物，研究表明山柰揮發(fā)油能夠影響DNA合成從而干擾細(xì)胞分裂[6-8]。山柰揮發(fā)油可以延長其生存期，而且體內(nèi)甲胎蛋白(AFP)表達(dá)也會(huì)下降，從而使瘤體質(zhì)地變軟，體積回縮[9]。使用山奈酚和山柰揮發(fā)油后，癌灶會(huì)穩(wěn)定或者縮小，還能緩解疼痛并且改善患者的進(jìn)食；提高患者的免疫力，不產(chǎn)生骨髓抑制，治療后患者的白細(xì)胞有升高的趨勢[10-11]。胃內(nèi)滯留型給藥是1種靶向治療，靶向治療是1腫瘤細(xì)胞過度表的某些分子為靶點(diǎn)，選擇針對性的阻斷劑，有效的調(diào)控于腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的信號，從而達(dá)到抑制腫瘤生長，進(jìn)展及轉(zhuǎn)移的效果[12]。本實(shí)驗(yàn)采用體外滯留型靶向給藥方式，通過用不同劑量藥物濃度處理胃癌細(xì)胞SGC-7901，然后檢測胃癌細(xì)胞增殖、凋亡情況，并觀察經(jīng)過藥物處理后胃癌細(xì)胞中COX-2和AFP的蛋白表達(dá)，從而探討山柰揮發(fā)油靶向給藥對胃癌治療的作用，為胃癌治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

RPMI 1640高糖培養(yǎng)基(杭州四季青生物工程有限公司，KGM31800S-500)；0.25%胰蛋白酶(含EDTA)(凱基生物有限公司，20170101)；青霉素鏈霉素混合液(索萊寶科技有限公司， 20160909)；胎牛血清(Fetal Bovine Serum，BI生物有限公司，1552680)；β-actin(中杉金橋，TA-09，1∶2 000)； COX-2(Cell Signaling，#12282，1∶1 000) ;AFP(abcom，ab133617，1∶50 000);迷你雙垂直電泳儀，迷你轉(zhuǎn)印電泳儀(北京六一儀器廠)；熒光定量PCR儀，熒光顯微鏡，ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；TE2000熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；FACSCalibur型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

SGC-7901胃癌細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，當(dāng)細(xì)胞的融合度達(dá)到90%以上時(shí)，棄去培養(yǎng)液，再用PBS洗2次，然后加入胰蛋白酶消化2 min，加入含10%FBS的1640，最后將細(xì)胞吹打下來并吸取到10 ml離心管中，離心，棄上清，注意不要碰到管口，加入1640完全培養(yǎng)基并接種到2個(gè)新的10 mm培養(yǎng)皿中，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 MTT檢測

在96孔板加入細(xì)胞100 μl/孔(約2×103個(gè))，置37 ℃5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，加入山柰揮發(fā)油，然后置于37 ℃5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育48 h。將5×MTT用Dilution Buffer稀釋成1×MTT，每孔加50 μl 1×MTT，在37 ℃孵育4 h，使MTT還原為甲臢。吸出上清液，每孔加150 μl DMSO使甲臢溶解，用平板搖床搖勻。酶標(biāo)儀在550 nm波長處檢測每孔的光密度。

1.4 流式檢測細(xì)胞凋亡

將細(xì)胞接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～70%時(shí)，在低劑量處理組和高劑量處理組中分別加入對應(yīng)濃度的藥物，然后置于37 ℃5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。48 h后，消化收集細(xì)胞，避光染色30 min上機(jī)檢測。按照Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書的方法，在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.5 流式檢測細(xì)胞周期

取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期的細(xì)胞，每孔按4×103個(gè)接種至12孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞轉(zhuǎn)染和加藥物處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，PBS洗細(xì)胞2次，加70%乙醇固定，用流式檢測儀檢測細(xì)胞周期。

1.6 Western blot檢測

取SGC-7901細(xì)胞加入相應(yīng)的裂解液，4 ℃裂解30 min，在10 000 rpm/min離心10 min，小心吸取上清，即得總蛋白。利用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定。蛋白變性、上樣、電泳1～2 h，濕法轉(zhuǎn)膜30～50 min。4 ℃孵育一抗溶液過夜；室溫孵育二抗1～2 h。在膜上滴加ECL曝光液，曝光。用“Quantity one”軟件分析各抗體條帶灰度值。

1.7 qPCR檢測

取SGC-7901細(xì)胞進(jìn)行RNA的提取，提取RNA后根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測，以GAPDH為內(nèi)參，算出各組組織中的COX-2、AFP表達(dá)量。引物序列如下：COX-2 F：TCAAATGAGATTGTGGGAAAATTG；COX-2 R：TCTAGTAGAGACGGACTCATAGAA；AFP F：CTGTTGCTGCCTTTGTTTGGA；AFP R：CTTCTTTGGGCTGCTCGCTAT；GAPDH F：CAATGACCCCTTCATTGACC；GAPDH R：GAGAAGCTTCCCGTTCTCAG。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析，用表示，經(jīng)t檢驗(yàn)顯著性差異，以P<0.05作為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測細(xì)胞增殖

如圖1所示，與對照組相比，藥物處理組細(xì)胞增殖率明顯降低，同時(shí)，高劑量處理組相比低劑量處理組，細(xì)胞增殖率更低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖1 MTT檢測細(xì)胞增殖

2.2 流式檢測細(xì)胞凋亡

如圖2所示，與對照組相比，藥物處理組凋亡率明顯增高，隨著藥物濃度增加，細(xì)胞凋亡率也增加。

圖2 流式檢測凋亡

2.3 流式檢測細(xì)胞周期

將低劑量和高劑量藥物分別加入細(xì)胞中，檢測對細(xì)胞周期的影響，經(jīng)分析，各組G1和S所占比例皆有所變化，隨著藥物濃度的增加，G1期加長，S期縮短，G2期變化不是很顯著，見表1。

表1 流式檢測細(xì)胞周期/%

2.4 Western blot 檢測

如圖3所示，與對照組相比，低劑量藥物組和高劑量藥物組細(xì)胞中COX-2和AFP蛋白的表達(dá)都有所下調(diào)，且隨著給藥濃度升高，表達(dá)量越低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.5 熒光PCR檢測

如圖4所示，與對照組相比，低劑量藥物組和高劑量藥物組細(xì)胞中COX-2和AFP基因的表達(dá)都有所下調(diào)，且隨著給藥濃度升高，表達(dá)量越低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論

我國胃癌死亡率較高，化療是目前癌癥治療主要手段，胃切除也是在胃癌治療的1種治療手段，但是化療后便會(huì)帶來食欲缺乏、毛發(fā)脫落和血細(xì)胞減少等副作用，而胃切除則因復(fù)發(fā)率較高而不能被廣泛使用。若使用普通抗癌藥，用藥后全身分布，也有較大的毒副作用。為解決癌癥治療中這一系列問題，近年來，使用天然產(chǎn)物藥物被認(rèn)為是預(yù)防和治療癌癥疾病的新型治療策略。山奈酚和山柰揮發(fā)油是1種存在于不同植物物種中的天然黃酮醇，被認(rèn)為具有抗炎性質(zhì)，許多植物性食品和草藥中皆含有這些成分[13]。此外，多項(xiàng)研究表明，山柰酚和山柰揮發(fā)油可以抑制人類癌細(xì)胞株的生長和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。本實(shí)驗(yàn)通過MTT檢測胃癌細(xì)胞的存活率，結(jié)果表明，山柰揮發(fā)油能夠抑制細(xì)胞的增殖，且隨著山柰揮發(fā)油藥物濃度的升高，細(xì)胞存活率明顯降低。流式檢測細(xì)胞凋亡的結(jié)果也證實(shí)了山柰揮發(fā)油對細(xì)胞凋亡起著促進(jìn)作用。流式檢測周期結(jié)果顯示，給藥后，細(xì)胞分裂受阻，滯留在S期和G2期。靶向給藥系統(tǒng)能將藥物定向輸送到靶器官，通過作用于體內(nèi)特定的腫瘤細(xì)胞，減少了藥物對正常組織的影響，而且藥物直接作用在特定位置，減少藥效分散，因此給藥時(shí)可以降低劑量，降低了藥物的毒副作用。因此靶向治療為腫瘤患者帶來了巨大的希望[15]。本實(shí)驗(yàn)以新型抗癌藥為模型，利用被動(dòng)靶向的機(jī)理，直接將藥物加入胃癌細(xì)胞，研究其作為靶向治療胃癌的可行性。實(shí)驗(yàn)材料易得，且無需昂貴實(shí)驗(yàn)設(shè)備，便能研究目的藥物對胃癌細(xì)胞的影響。COX-2即環(huán)氧合酶2，關(guān)于乳腺癌、結(jié)腸癌等各種癌癥的研究表明，該基因和蛋白在癌細(xì)胞中都是高表達(dá)[16-17]。對照組中COX-2的表達(dá)量也證實(shí)了其在胃癌中一樣是高表達(dá)。然而在加入不同劑量的山柰揮發(fā)油藥物處理后，COX-2的表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，與低劑量組相比，高劑量組中的COX-2表達(dá)更低。早期研究表明，甲胎蛋白(AFP)在胃癌細(xì)胞分化中起著重要作用，不含AFP的胃癌細(xì)胞相比，產(chǎn)生AFP的胃癌更具侵略性，侵襲作用和轉(zhuǎn)移能力更強(qiáng)，并表明如要抑制AFP的產(chǎn)生，最佳方式是個(gè)體化用藥，即本實(shí)驗(yàn)中的靶向用藥[18]。本實(shí)驗(yàn)通過檢測給藥組和對照組中AFP的基因和蛋白表達(dá)，PCR和Western blot兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果皆證明，加入藥物后，AFP表達(dá)下調(diào)，尤其是高劑量藥物處理組，下調(diào)趨勢更加明顯。因此證明，山柰揮發(fā)油可以抑制AFP的產(chǎn)生和表達(dá)，同時(shí)也證明靶向用藥確實(shí)對AFP的產(chǎn)生和表達(dá)影響較大。為以后新藥研發(fā)和胃癌治療奠定了理論基礎(chǔ)。

綜上所述，山柰揮發(fā)油可以抑制胃癌細(xì)胞的分裂、增殖和擴(kuò)散，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，并影響細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果證實(shí)，胃癌的靶向治療，是胃癌治療的1種新的技術(shù)，是對胃癌患者有更好的康復(fù)希望。胃癌早期及時(shí)的靶向治療，對患者的康復(fù)作用很大。

圖3 Western blot 檢測COX-2、AFP表達(dá)

圖4 PCR檢測COX-2和AFP基因表達(dá)