高蕓 康林 祝瑩 黃瑾

(雅安市人民醫(yī)院干部?jī)?nèi)科, 四川 雅安 625000)

胰高血糖素樣肽-1(GLP-1，Glucagon like peptide-1)是人體內(nèi)重要的激素，主要由小腸L細(xì)胞合成并分泌，可有效作用于胰島β細(xì)胞，促進(jìn)釋放胰島素，實(shí)現(xiàn)有效控制機(jī)體內(nèi)胰高血糖素水平[1]。人體內(nèi)GLP-1可有效改善氧化應(yīng)激和炎癥損傷，有效保護(hù)胰島細(xì)胞，并可有效抑制胰島細(xì)胞凋亡和氧化[2]?，F(xiàn)階段，臨床常采用皮下注射方式進(jìn)行GLP-1類藥物治療，因而常導(dǎo)致患者長(zhǎng)期治療依從性較差。近年，基因治療日益成為臨床新興的治療手段，其可特異性編碼某種蛋白質(zhì)，并利用口服灌胃方式將重組表達(dá)載體置入體內(nèi)，可有效實(shí)現(xiàn)在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)基因，起到治療和預(yù)防疾病的作用[3]。一般情況下，由于減毒沙門(mén)菌可通過(guò)腸壁M細(xì)胞到達(dá)Peyer淋巴結(jié)，可在腸系膜相關(guān)淋巴組織中進(jìn)行定位，并經(jīng)淋巴結(jié)侵襲達(dá)脾臟、肝臟等腫瘤組織和器官，有效刺激呈遞基因、機(jī)體免疫等作用[4]。既往研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌、黑色素瘤、肺癌及胃癌等患者采用重組減毒沙門(mén)菌治療具有較高臨床療效[5]。但現(xiàn)階段GLP-1重組減毒沙門(mén)菌的應(yīng)用仍鮮有報(bào)道。本研究采用GLP-1重組減毒沙門(mén)菌對(duì)2型糖尿病小鼠干預(yù)，分析GLP-1重組減毒沙門(mén)菌治療對(duì)2型糖尿病小鼠的Caveolin-1、胰島β細(xì)胞自噬相關(guān)因子的影響。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取40只SPF級(jí)昆明種健康清潔級(jí)4周齡小鼠，分為正常組、對(duì)照組、空載組及治療組，每組各10只。所有小鼠均在SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)條件喂養(yǎng)，所有小鼠、飼料及墊料均購(gòu)買(mǎi)自南京大學(xué)模式動(dòng)物中心，自由攝食及飲水，環(huán)境溫度24～26 ℃，本研究經(jīng)雅安市人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 儀器與試劑 本組研究中所用血糖儀購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)強(qiáng)生公司，鏈脲佐菌素(STZ，Streptozotocin)購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Sigma公司。

1.2.2 質(zhì)粒于菌株 GLP-1蛋白質(zhì)粒pcDNA3.3-GLP1、減毒沙門(mén)氏菌菌株Ty21a控pcDNA3-flag均購(gòu)買(mǎi)自上海生工生物有限公司。

1.2.3 重組減毒沙門(mén)菌構(gòu)建 本組研究中使用構(gòu)建好的質(zhì)粒制備減毒沙門(mén)菌感受態(tài)，將50μL減毒沙門(mén)菌感受態(tài)細(xì)胞及1μL質(zhì)粒置于電擊杯中，后將參數(shù)設(shè)定為0.8 ms，2399V進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)成功后挑選單克隆菌種，提取DNA擴(kuò)增，后行鑒定。鑒定成功后涂板，過(guò)夜挑選菌種，鑒定克隆菌中是否存在GLP-1基因。

1.2.4 造模及分組造模 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，將小鼠分為造模30只，10只正常培養(yǎng)作為正常組。造模小鼠給予60%高脂飼料，正常組小鼠給予10%低脂對(duì)照飼料，均輻照飼料，定時(shí)更換鼠水、鼠籠及飼料，4周后過(guò)夜禁食，空腹12小時(shí)以上，稱量空腹體質(zhì)量并記錄，后空腹注射STZ(65 mg/kg)，72小時(shí)后，使用微量血糖儀檢測(cè)空腹血糖，血糖≥11.1mol/L則判定為造模成功，成功后分為對(duì)照組、空載組及治療組。

1.2.5 重組減毒沙門(mén)菌干預(yù) 造模成功120小時(shí)后進(jìn)行干預(yù)，正常組每組灌胃100 μL 5% NaHCO3溶液、對(duì)照組每組灌胃100 μL 5% NaHCO3溶液、空載組每只灌胃100 μL pcDNA3減毒沙門(mén)菌，菌液濃度109/mL、治療組每只灌胃100 μL pcDNA3-GLP-1減毒沙門(mén)菌，菌液濃度109/mL，所有組別均治療28天。

1.3 檢測(cè)指標(biāo) 在造模前、造模成功后及治療結(jié)束后進(jìn)行眼眶取血0.5 mL，使用血糖儀檢測(cè)血中血糖水平。在治療結(jié)束后使用水合氯醛麻醉后斷頭處死，冰上解剖并分離胰腺組織，使用液氮保存并標(biāo)記。取胰腺組織分成兩塊，使用RIPA裂解液提取總蛋白，后使用Western Blot法檢測(cè)Caveolin-1及β-actin水平，并使用Caveolin-1/β-actin表示Caveolin-1水平。取另一塊胰腺組織使用RT-PCR法檢測(cè)β胰島細(xì)胞中Atg3、Atg12及Beclin1 mRNA水平，本組研究反應(yīng)體系26.5 μl，其中上下游引物各1μl(5 μmol/L)，Sybr Premix Ex Taq 13 μl，cDNA 2.5 μl，滅菌水9 μl，選擇GAPDH作為管家基因，計(jì)算各mRNA相對(duì)表達(dá)量。所用試劑盒購(gòu)買(mǎi)自羅氏公司，見(jiàn)表1。

表1 引物表Table 1 The primers

2 結(jié)果

2.1 治療前后各組血糖水平檢測(cè)結(jié)果 治療后治療組小鼠血糖水平顯著低于對(duì)照組及空載組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 治療前后各組血糖水平檢測(cè)結(jié)果Table 2 Blood glucose levels before and after treatment

注：治療組與對(duì)照組、空載組比較，①P<0.05

2.2 治療后各組胰島Caveolin-1水平檢測(cè)結(jié)果 治療后，治療組小鼠胰島Caveolin-1水平顯著高于對(duì)照組及空載組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，對(duì)照組及空載組Caveolin-1水平無(wú)明顯差異(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 治療后各組Caveolin-1水平檢測(cè)結(jié)果Table 3 Caveolin-1 levels after treatment

注：治療組與對(duì)照組、空載組比較，①P<0.05

2.3 治療后各組自噬相關(guān)因子表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果 治療后,治療組小鼠胰島Atg3、Atg12及Beclin1水平顯著低于對(duì)照組及空載組(P<0.05)，對(duì)照組及空載組Atg3、Atg12及Beclin1水平無(wú)明顯差異(P>0.05)，見(jiàn)表4。

表4 治療后各組自噬相關(guān)因子表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果Table 4 levels of autophagy related factors after treatment

注：治療組與對(duì)照組、空載組比較，①P<0.05

3 討論

隨著我國(guó)人民生活水平不斷提高，人口老齡化趨勢(shì)的不斷加重，膳食結(jié)構(gòu)不斷改變，我國(guó)2型糖尿病的臨床發(fā)病率逐漸增加，且存在諸多糖尿病前期患者，因此，2型糖尿病的臨床及日常防治趨勢(shì)日益嚴(yán)峻。有研究顯示，在2型糖尿病的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中，胰島素功能障礙及胰島素抵抗起到十分重要的作用，在發(fā)病過(guò)程中可能伴有胰島細(xì)胞凋亡、持續(xù)性損害及胰島功能衰退[6]。一般情況下，在對(duì)2型糖尿病患者進(jìn)行治療時(shí)側(cè)重于控制血糖水平，但并未有效控制糖尿病的癥狀及多種并發(fā)癥，且無(wú)法實(shí)現(xiàn)從根本上緩解胰島功能，也無(wú)法有效促進(jìn)胰島細(xì)胞增殖[7]。此外，在傳統(tǒng)療法的長(zhǎng)期治療過(guò)程中可能導(dǎo)致低血糖、體重增加及胰島細(xì)胞功能衰竭等諸多不良反應(yīng)。在防治2型糖尿病時(shí)，有效降低血糖同時(shí)促進(jìn)β細(xì)胞增殖抑制其凋亡并保護(hù)胰島功能是最佳途徑[8]。與傳統(tǒng)的胰島素治療及降糖藥治療方案相比，GLP-1類似物治療具有諸多優(yōu)點(diǎn)，其可使胰島β細(xì)胞有效避免炎癥和高糖損害，刺激增殖[9]。采用GLP-1類似物治療后可顯著改善胰島素抵抗，提高外周組織敏感性，延緩胃排空，抑制食欲，盡可能避免吸收能量物質(zhì)，有助于控制體重和血糖[10]。此外，GLP-1類似物可有效改善糖化血紅蛋白等中長(zhǎng)期生化指標(biāo)，促進(jìn)胰島素分泌，避免發(fā)生低血糖，改善神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)，提高抗炎能力，提高長(zhǎng)期使用安全性[11]?，F(xiàn)階段，國(guó)內(nèi)外GLP-1類似物多采用化學(xué)合成，其純化相對(duì)困難、工藝復(fù)雜、價(jià)格昂貴、生產(chǎn)成本高，因而常需皮下注射，導(dǎo)致治療依從性較差。因此臨床中亟待研究廉價(jià)、高效的GLP-1類似物以對(duì)2型糖尿病進(jìn)行治療。

現(xiàn)階段常采用STZ誘導(dǎo)小鼠糖尿病模型應(yīng)用于2型糖尿病，GLP-1類似物藥物可顯著控制STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠血糖，改善胰島損傷[12]。本組研究結(jié)果顯示，采用構(gòu)建編碼GLP-1序列質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入減毒沙門(mén)菌中，后灌胃治療，結(jié)果顯示GLP-1重組減毒沙門(mén)菌有較理想的降糖效果，改善糖尿病小鼠的體重變化及多食多飲癥狀。Caveolin-1在機(jī)體內(nèi)以二聚體形式存在，主要存在于小凹結(jié)構(gòu)細(xì)胞膜側(cè)，隨著研究深入，其糖代謝作用逐漸被解釋。有研究顯示，Caveolin-1在糖代謝過(guò)程中逐漸被廣泛認(rèn)識(shí)，敲除Caveolin-1后，小鼠可見(jiàn)脂肪組織萎縮，在正常飲食干預(yù)后仍會(huì)出現(xiàn)胰島素抵抗，提示機(jī)體胰島素敏感性與Caveolin-1密切相關(guān)[13]。本組研究結(jié)果顯示，采用GLP-1重組減毒沙門(mén)菌治療后，可有效改善Caveolin-1水平，改善胰島素抵抗，提高治療效果。機(jī)體自噬可有效利用細(xì)胞因子或高分子蛋白與自噬溶酶體和細(xì)胞器相互作用，溶解細(xì)胞，促使胰島細(xì)胞凋亡，Atg3、Atg12、Beclin-1蛋白有利于自噬體的形成，影響細(xì)胞凋亡[14-15]。其中，Beclin-1是機(jī)體內(nèi)重要的自噬相關(guān)基因，有效調(diào)節(jié)并促進(jìn)溶酶體膜和自噬泡膜相互融合，并與Bcl-1相互作用影響凋亡，進(jìn)而造成胰島細(xì)胞凋亡[16]。Atg12屬泛素樣蛋白成員，介導(dǎo)自噬體膜拓展，Mcl-1蛋白與BH3樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合，影響細(xì)胞凋亡[17-18]。LC3-1脂溶性反應(yīng)在Atg3催化下可進(jìn)一步加速，并與Atg12形成復(fù)合物，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19-20]。本組研究結(jié)果顯示，GLP-1重組減毒沙門(mén)菌治療后，可有效改善Atg3、Atg12及Beclin-1水平，改善胰島細(xì)胞凋亡，保證胰島β細(xì)胞合成胰島素及分泌能力，阻滯細(xì)胞自噬，實(shí)現(xiàn)抑制胰島細(xì)胞凋亡，實(shí)現(xiàn)治療糖尿??；移植GLP-1重組減毒沙門(mén)菌可有效調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)Caveolin-1、Atg3、Atg12及Beclin-1蛋白水平，進(jìn)而起到降低STZ誘發(fā)糖尿病小鼠體內(nèi)血糖的作用。

4 結(jié)論

采用GLP-1重組減毒沙門(mén)菌治療可有效改善2型糖尿病小鼠Caveolin-1及胰島β細(xì)胞自噬相關(guān)因子表達(dá)，具有較廣的應(yīng)用價(jià)值。但口服重組減毒沙門(mén)菌后的體內(nèi)分布情況及胃腸道環(huán)境對(duì)減毒沙門(mén)菌的影響尚待深入研究，且研究移植GLP-1重組減毒沙門(mén)菌后，影響Caveolin-1、Atg12及Beclin1水平的機(jī)制，亦有待后續(xù)深入拓展研究。