田劍剛 鐘翠翠 黃瑞哲 張盤諫 陳慶秀 阮建平

(1.西安交通大學口腔醫(yī)院預防科,陜西 西安 710004；2. 山東省陽谷縣人民醫(yī)院口腔科，山東 陽谷 252300；3.西安交通大學第二附屬醫(yī)院皮膚科，陜西 西安 710004)

氟牙癥的形成是由于牙齒發(fā)育期攝入過量的氟化物，導致釉質(zhì)發(fā)育不全而釉質(zhì)表現(xiàn)白堊色條紋、斑塊、缺損等。目前認為釉原蛋白水解延遲和清除障礙是導致氟牙癥形成的原因，從而影響了相關蛋白的表達，但具體的作用機制尚不清楚[1]。泛素-蛋白酶體途徑是細胞內(nèi)蛋白水解的重要途徑之一，其介導的細胞內(nèi)蛋白選擇性降解是細胞調(diào)控的重要機制。泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)作為泛素-蛋白酶體途徑中的泛素再循環(huán)酶，曾被觀察到出現(xiàn)于分泌期的成釉細胞內(nèi)，提示泛素-蛋白酶體途徑可能在釉質(zhì)的形成中具有一定的作用[2]。本研究通過免疫組化和實時定量PCR方法觀察氟化物對其表達的影響，為進一步探索氟牙癥的形成機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑 12周齡清潔級SD大鼠(西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心)；兔抗大鼠UCH-L1一抗(Biomol Company，USA)；即用型SABC試劑盒及DAB 顯色試劑盒(博士德生物工程有限公司)；RNA FAST200試劑盒(上海飛捷公司)； PrimeScript RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTMII PCR試劑盒(TaKaRa公司)；GAPDH引物(北京奧科鼎盛生物公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 氟中毒動物模型的建立與取材 按本實驗組已有的方法[3]，將9只妊娠10 天的大鼠隨機分為對照組、低氟組和高氟組，每組3只，分別飼以去離子水和濃度為50、200 mg/L的含氟飲水,建立仔鼠成釉細胞氟中毒模型。待妊娠21 天時，乙醚麻醉下，隨機選取10只胎鼠，切取下頜第一磨牙牙胚部位的下頜骨段，在4 % PFA中固定，石蠟包埋。其余胎鼠取下頜第一磨牙牙胚，采用Trizon法提取總RNA。

1.2.2 免疫組化染色及結果判定 每組10個蠟塊做連續(xù)5 μm切片，HE染色，光鏡下觀察定位成釉器。采用SABC法免疫組化染色，主要步驟包括：切片脫蠟至水，3%過氧化氫液室溫30 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中采用微波法修復抗原，5%BSA封閉液60 μl封閉抗原，滴加一抗在濕盒內(nèi)4 ℃過夜孵育，滴加二抗在濕盒內(nèi)37℃孵育60min，滴加SABC室溫孵育40 min，新鮮配置DAB顯色液顯色1 min，蒸餾水洗片，蘇木素輕度復染，脫水透明封片，光鏡下觀察。染色結果判定：以PBS染色作為陰性對照，UCH-L1的陽性染色為在成釉細胞胞質(zhì)及釉質(zhì)基質(zhì)內(nèi)可見棕黃色顆粒。每組10個樣本中選擇雜質(zhì)少、牙胚組織完整且未復染的SABC染色切片各一張，同一感光條件下，每張切片在其陽性染色區(qū)域內(nèi)隨機選取不重疊的6個視野區(qū)域進行圖像采集，每個視野保存為1張圖片。采用Image-Pro Plus 5.1測量染色光密度值，每張切片所測得的6個視野的均值代表該樣本蛋白的表達水平，每組10個樣本的均值代表該組的平均蛋白表達水平。

1.2.3 實時定量PCR 以牙胚提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR，用于UCH-L1 mRNA的檢測。引物序列：內(nèi)參對照GAPDH-upper-5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′; GAPDH-lower-5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′；UCH-L1-upper 5′-GGGGGTTTGGTTTGTATTATTTT-3′；UCH L1-lower 5′-CCACCTCCATTACACAAAAC-3′。逆轉(zhuǎn)錄體系：5×PrimeScriptBuffer 2μl，PrimeScriptRT Enzyme Mix I 0.5μl，Oligo dT Primer(50μM)0.5μl， Random 6 mers(100 μM)0.5μl，加無RNA酶水至總體積10μl。PCR擴增體系：SYBR Premix Ex TaqII(Tli RNaseH Plus)(2×)10μl，PCR Forward Primer(10μM)0.8μl，PCR Reverse Primer(10μM)0.8μl， ROX Reference Dye or Dye II(50×)0.4μl，待測樣品cDNA2μl，加無RNA酶水至總體積20μl。反應條件：預變性為95℃進行30s，之后變性為95℃進行5s，退火后60℃延伸30s，進行40個循環(huán)后結束。每個樣本做3個復孔，重復3次。計算各組ΔCT均值，比較目的基因在各組之間的表達差異。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 12.0 統(tǒng)計學軟件對所得3組圖像分析數(shù)據(jù)及各組ΔCt值進行單因素方差分析，檢驗水準α= 0. 05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 光鏡下觀察 鏡下可見牙胚成釉細胞呈高柱狀單層排列，牙尖部位的成釉細胞已開始分泌少量釉基質(zhì)蛋白。與之相對應成牙本質(zhì)細胞也呈單層排列在基底膜的另一側(cè)，并也開始分泌牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白。對照組胎鼠成釉細胞胞漿黃染，染色較為均勻，說明此時UCH-L1在成釉細胞表達呈陽性；低氟組胎鼠成釉細胞間隙較對照組增大，胞漿黃染減弱；高氟組胎鼠成釉細胞排列不齊，細胞間隙增大，并且形成囊泡，成釉細胞胞漿黃染較對照組明顯減弱，且染色不均，甚至消失，見圖1。

圖1 各組牙胚中成釉細胞UCH-L1的表達染色情況(SABC染色，×400)Figure 1 Immunohistochemical results of UCH-L1注：A.對照組；B.低氟組；C.高氟組

2.2 圖像分析 切片中陽性表達水平強則標本染色深、透光弱、光密度值低；反之，則標本染色淺，透光強，光密度值高。測得各組灰度值結果。由單因素方差分析得出，3組大鼠之間UCH-L1表達的光密度值不全相同，差異有統(tǒng)計學意義(F=109.102，P<0.01)；經(jīng)過SNK法兩兩比較，各組之間的灰度值差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見表1。

表1各組中UCH-L1表達的平均光密度值

Table1TheaverageopticaldensityofUCH-L1indifferentfluoridegroups

分組n均值95%CI下限上限0 mg/L10167.9165.6170.350 mg/L10176.0173.5178.5200 mg/L 10189.0186.9191.1

2.3 實時定量PCR結果 UCH-L1、GAPDH PCR擴增曲線CT 閾值集中，且均在30個循環(huán)前到達熒光閾值，表明反應靈敏、過程穩(wěn)定、各管定量精準；引物的溶解曲線求導曲線均為單一峰值，表明引物特異性良好，實驗結果可靠。采用ΔCT 法計算目的基因UCH-L1的相對表達量，GAPDH作為內(nèi)參對照，ΔCT= CT目的基因-CT內(nèi)參，將3次重復實驗中對照組的ΔCT相加取平均值作為ΔCT校正，對每組ΔCT均值進行統(tǒng)計學分析。ΔΔCT=ΔCT實驗組-CT校正，根據(jù)公式可以算出目的基因在高氟(低氟)組的表達/目的基因在對照組的表達(2-ΔΔCT)。由單因素方差分析得出，3組大鼠之間UCH-L1表達的ΔCT均值不全相同，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。

表2不同染氟組子鼠牙胚組織中UCH-L1mRNA的表達

Table2ThemRNAexpressionofUCH-L1intheToothgermofoffspringratsindifferentfluoridegroups

分組ΔCT 2-ΔΔCTFP0 mg/L8.191.00150 mg/L8.920.6021055.7240.000200 mg/L 10.590.189

3 討論

成釉細胞的主要功能是合成及分泌釉基質(zhì)蛋白，進而礦化形成牙釉質(zhì)，目前認為氟牙癥的發(fā)生與氟離子抑制了成釉細胞分泌相關的釉基質(zhì)蛋白水解酶有關[4]。分泌性蛋白是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中折疊、修飾后，形成有活性功能的蛋白質(zhì)分泌到胞外。Kubota等[5]及Sharma等[6]研究證實，氟化物影響下成釉細胞中未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)積累增多，導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，進而激活未折疊蛋白反應(UPR)。泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)是真核細胞降解變異蛋白、錯誤折疊蛋白及異常聚集蛋白等的主要途徑之一，未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)可進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解途徑，被轉(zhuǎn)運至胞漿中，通過UPS降解，從而降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負擔，維持細胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)[7-8]。Wei等[9]進一步研究發(fā)現(xiàn)，氟化物引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應及UPR導致了釉基質(zhì)蛋白水解酶合成分泌的減少，導致釉質(zhì)中蛋白質(zhì)的滯留。目前研究認為[10]內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、UPR與氟牙癥存在著某些共同因素的聯(lián)系。當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激持續(xù)存在的情況下，可引起細胞凋亡。已有許多研究證實氟影響下成釉細胞凋亡增加,路徑各異[11-14]。因此，我們推測氟化物可能通過影響UPS，導致成釉細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊與未折疊的蛋白不能及時降解而增多，進而加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，使得細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，影響成釉細胞的功能，進而通過不同途徑誘導細胞凋亡，引起一系列氟牙癥的病理改變。

UCH-L1是一個由9個外顯子編碼，由223個氨基酸組成的硫醇蛋白酶，其基因定位于人類染色體4p14，是UCH 家族的四種蛋白之一，曾被稱為蛋白基因產(chǎn)物9.5(PGP9.5)，被認為是神經(jīng)組織的特異性蛋白而作為神經(jīng)標記物[15]。隨著對UPS研究的深入，UCH-L1的功能逐漸被人們所關注，并發(fā)現(xiàn)其不僅在神經(jīng)系統(tǒng)的生理、病理中發(fā)揮特定的作用[16-17]，在多種疾病及腫瘤中也具有重要的作用[18]。對于UCH-L1的功能，一些研究認為UCH-L1使錯誤標記的底物蛋白去泛素化，從而阻止目標蛋白的水解[19]；也有另一些研究認為UCH-L1可使多聚泛素鏈從26S蛋白酶體上分離下來，這樣目標蛋白被26S蛋白酶體降解，而使泛素釋放并重新進入循環(huán)，從而促進目標蛋白的水解[20]?？傮w上目前普遍認為UCH-L1集三種功能于一身，不僅具有去泛素化功能，還有連接泛素及穩(wěn)定單體泛素的功能，因此能夠調(diào)節(jié)目標蛋白的降解速度[21]。目前UCH-L1 的蛋白含量、基因表達及作用是UPS的研究熱點之一。

據(jù)前期研究觀察，SD大鼠妊娠周期為21～22天，妊娠21天的胎鼠磨牙，牙胚處于鐘狀期[3]，此時成釉細胞處于分泌期，持續(xù)1～2天，分泌大量蛋白隨后進入成熟期。UCH-L1的表達在此時處于牙胚發(fā)育各階段的高峰[2]，因此本實驗選擇其作為研究對象，通過氟牙癥動物模型，初步觀察了在牙胚發(fā)育的釉基質(zhì)蛋白分泌期氟化物對UCH-L1表達的影響。從實驗結果可以看出，在氟中毒大鼠的成釉細胞中，無論從蛋白水平還是mRNA水平，UCH-L1的表達降低。表達的降低意味著功能的減弱，因此可以初步推斷氟牙癥發(fā)病過程中，UPS功能降低，導致未折疊及錯誤折疊的蛋白降解受阻而增多，出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應，這可能與UCH-L1受到氟化物影響有關。本實驗還觀察到，在氟中毒大鼠的成釉細胞中，高氟濃度組的UCH-L1表達較低氟濃度組進一步降低，可能存在劑量反應關系，這與氟牙癥牙齒的臨床表現(xiàn)隨著攝入氟濃度的增高而加重是一致的。

4 結論

在氟中毒大鼠分泌期成釉細胞中，UCH-L1的表達降低，并且隨著氟劑量的不同而表達降低的程度不同，說明氟化物對UCH-L1的表達有抑制作用。但此種影響是直接還是間接，其作用的分子機制如何，UPS在釉質(zhì)發(fā)育中具體的作用機制以及氟化物對UPS通路各環(huán)節(jié)的影響，仍需進一步研究。