宋康 姚勇利 梁宏 徐啟玉

(1.青海省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科,青海 西寧 810001 ；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，青海 西寧 810001；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 咸陽 712100)

2型糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是由多種因素綜合作用引起的一種代謝性疾病[1]。增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病變 (Proliferative diabetic retinopathy, PDR)是糖尿病的慢性并發(fā)癥之一，包括新生血管的形成，玻璃體積血或視網(wǎng)膜前出血[2]。近年來，青海省增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病變的發(fā)病率逐年增長。視網(wǎng)膜新生血管如何形成及其作用機(jī)制目前尚不清楚。本文從NCBI(National Center for Biotechnology Information)的GEO(Gene Expression Ommibus)數(shù)據(jù)庫中選取了2組RNA-Seq高通量測序數(shù)據(jù)并進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)分析，同時(shí)結(jié)合青海省不同海拔地區(qū)臨床資料擬對(duì)增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究，為臨床診斷及治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015年9月～2016年9月青海省人民醫(yī)院確診為PDR的患者70例為PDR組，其中男性36例，平均年齡(57.32±5.28)歲，女性34例, 平均年齡(56.28±3.65)歲。并收集我院同時(shí)期健康體檢中心患者65例為對(duì)照組，其中男性33例，平均年齡(55.86±4.31)歲，女性32例，平均年齡(55.03±3.05)歲。根據(jù)居住地海拔進(jìn)行分組，分為西寧地區(qū)組(67例)和高海拔地區(qū)組(68例)。因西寧海拔為2295m,故設(shè)定西寧地區(qū)組(海拔≤2500m)，其余患者及健康人群均為居住地在2500～4500m米，故設(shè)定為高海拔地區(qū)組(2500

1.2 入選與排除標(biāo)準(zhǔn) 入選標(biāo)準(zhǔn)：①糖尿病診斷依據(jù)符合1999年世界衛(wèi)生組織(WHO)診斷標(biāo)準(zhǔn)。②合并增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變。③居住地海拔在≤4500m。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并糖尿病急性并發(fā)癥。②有嚴(yán)重心腦血管并發(fā)癥。③急、慢性感染者。④近期有創(chuàng)傷、外科手術(shù)者。⑤長期肝腎等臟器疾病及其他內(nèi)分泌疾病。⑥妊娠期婦女。⑦非增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變。⑧同時(shí)合并其他眼底病變。⑨居住地海拔>4500m。

1.3 方法

1.3.1 RNA-Seq高通量數(shù)據(jù)處理及差異基因篩選 從NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫下載相應(yīng)數(shù)據(jù)集SRA格式的原始文件，隨后使用NCBI的SRA Toolkit工具將其轉(zhuǎn)化Fastq格式的讀取序列，為簡便進(jìn)行后續(xù)分析，R語言下使用命令行相應(yīng)組名代替序列文件名。隨后利用FastQC軟件工具對(duì)Fastq格式的原始RNA-Seq序列進(jìn)行質(zhì)量檢測，并使用NextGen Sequence Workbench工具設(shè)置相應(yīng)參數(shù)對(duì)低質(zhì)量序列進(jìn)行初步處理。處理完后，下載人類基因組序列文件，注釋文件以及相應(yīng)的INDEX文件，使用Tophat 和Bowtie工具進(jìn)行比對(duì)，獲得相應(yīng)的序列比對(duì)文件信息。最后使用R語言的CummeRbund軟件包進(jìn)行差異基因表達(dá)分析，根據(jù)Trapnell 等(2012)[3]中所述方法對(duì)差異基因進(jìn)行篩選，篩選參數(shù)設(shè)置為P<0.01，|Log2(Fold change)|>1。且Log2(Fold change)>1時(shí)基因表達(dá)上調(diào)，Log2(Fold change)<-1時(shí)基因表達(dá)下調(diào)。

1.3.2 差異基因蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 STRING(Protein-Protein Interaction Networks, STRING)是蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域最大的數(shù)據(jù)庫之一，現(xiàn)包括2031個(gè)物種的9 600 000種蛋白質(zhì)，收集相互作用蛋白數(shù)量達(dá)138000000，可以方便快捷的預(yù)測蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系[4-7]。本文將所篩選差異基因?qū)氲絊TRING(https://string-db.org/)在線工具中，選擇物種為Homo Sapiens，并準(zhǔn)確選擇每個(gè)所識(shí)別基因的名稱(本文中STRING共識(shí)別出85個(gè)基因)，對(duì)所識(shí)別差異基因進(jìn)行蛋白相互作用分析，找出關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白。

1.3.3 IGF基因的生物信息學(xué)分析 本文對(duì)篩選的IGF基因進(jìn)行了初步生物信息學(xué)分析：利用ExPasy的Translate tool[8-12]將其基因序列翻譯為蛋白質(zhì)序列，利用3djigsaw將翻譯的蛋白質(zhì)序列提交到PDB(Protein DataBank)數(shù)據(jù)庫中，并使用RasMol(http://www.openrasmol.org/)工具構(gòu)建該蛋白質(zhì)的三維立體結(jié)構(gòu)。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Quantitative Real-time PCR) 對(duì)ACSL5、IGF和CPS1基因的定量分析

1.3.4.1 總RNA提取及cDNA模板制備 按TRIZOL試劑說明書提取總RNA，抽取外周血，4℃ 離心，4000 g，10 min。室溫干燥RNA沉淀，適量RNase-free H2O 溶解RNA。按照試劑盒的說明書(Imprim-ⅡTM，Promega)進(jìn)行RNA的逆轉(zhuǎn)錄。

1.3.4.2 SYBR GREEN法引物設(shè)計(jì) 通過分析，本文選取了ACSL5、IGF和CPS1三個(gè)基因作為增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變并可能與海拔有關(guān)聯(lián)的候選基因。通過NCBI查找并下載該基因的CDS區(qū)序列，由于每個(gè)基因具有不同的剪切體，而對(duì)不同剪切體使用MEGA 6進(jìn)行同源序列比對(duì)后，對(duì)保守區(qū)利用Beacon Designer 7 軟件設(shè)計(jì)SYBR GREEN法熒光定量PCR的引物，引物序列如下： ACSL5-Forward: CCGTCTTACCTCTTCTTGA, ACSL5-Reverse: CATACATAGTCTTGGCATCTG; IGF-Forward: TAGTGAGTCGGAGGAAGA, IGF-Reverse: GGTATCTGTGCTCTGAGA；CPS1-Forward: TTGATTGGTGTGCTGTCT, CPS1-Reverse: GCCTCCTGATGGTAGATG。

1.3.4.3 qRT-PCR程序 設(shè)復(fù)孔，在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)： 94℃初始變性4min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，重復(fù)該循環(huán)40個(gè)，最后用2-△△CT對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 差異基因篩選及其GO富集和信號(hào)通路分析 本研究從NCBI的GEO數(shù)據(jù)集GSE94019中共篩選到差異表達(dá)基因621個(gè)，其中499個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，122個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，從數(shù)據(jù)集GSE60436中共篩選到差異表達(dá)基因736個(gè)，其中523個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，213個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，從這兩個(gè)數(shù)據(jù)集中共同篩選出了差異基因97個(gè)，其中60個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，37個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，見表1。

表1 差異基因篩選Table1 The expressed differentially genes of GEO datasets

利用DAVID在線分析工具對(duì)差異基因進(jìn)行了GO富集和KEGG信號(hào)通路分析，結(jié)果顯示這些差異表達(dá)基因主要參與到細(xì)胞組成的組織或合成、生物調(diào)控、刺激反應(yīng)、發(fā)育進(jìn)程、代謝過程、免疫系統(tǒng)過程等生物學(xué)過程，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性等分子功能，細(xì)胞凋亡信號(hào)通路、胰島素/胰島素樣生長因子通路的蛋白激酶信號(hào)級(jí)聯(lián)、炎癥趨化因子和細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、PI3激酶通路、Ras通路、帕金森、亨廷頓病、丙酮酸代謝、5-羥色胺降解、TCA循環(huán)Fas信號(hào)通路等信號(hào)通路，見表2。

2.2 差異基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 通過 STRING 10.5 在線工具對(duì)所篩選的差異基因進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果顯示CPS1、ACSL5、VEGF、IGF、TGF、OTC、ANGPTL4、CTGF、PDK1與HMGCS2蛋白與其他蛋白存在比較明顯的相互作用關(guān)系，為此蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點(diǎn)，見圖1。

表2差異基因的GO分析和KEGG信號(hào)通路分析

Table2GOtermsandKeggpathwaysofdifferentiallyexpressedgenes

生物學(xué)過程數(shù)目(個(gè))P細(xì)胞組分合成細(xì)胞過程定位再生生物調(diào)控應(yīng)激反應(yīng)發(fā)育進(jìn)程多細(xì)胞生物過程代謝過程免疫系統(tǒng)過程凋亡信號(hào)通路胰島素/胰島素樣因子的蛋白激酶信號(hào)級(jí)聯(lián)通過趨化因子和細(xì)胞因子介導(dǎo)炎癥信號(hào)通路帕金森病亨廷頓病丙酮酸代謝5-羥色胺降解三羧酸循環(huán)FAS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路氨基丁酸降解賴氨酸生物合成白細(xì)胞介素信號(hào)通路整合素信號(hào)通路p53通路的反饋回路糖酵解精氨酸生物合成43581126446456143691111512111118. 64E-043. 32E-025. 14E-032. 24E-046. 74E-058. 30E-036. 26E-039. 03E-024. 37E-054. 64E-028.14E-052. 35E-034. 36E-033. 84E-035. 64E-022. 86E-033. 34E-046. 32E-035. 27E-024. 14E-022. 18E-048. 04E-025. 58E-023. 65E-034. 36E-022. 35E-03

圖1差異基因蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

Figure1Protein-proteininteractionnetworkanalysisofthedifferentiallyexpressedgenes

2.3 正常人群和增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者ACSL5、IGF和CPS1核酸水平的變化 西寧地區(qū)PDR患者與健康體檢者比較，ACSL5、CPS1的水平下降，IGF的水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高海拔地區(qū)(2500

表3 各種指標(biāo)的mRNA水平的變化Table 3 Expression level of kinds of genes

注：與西寧健康對(duì)照組比，①P<0.05;與高海拔健康對(duì)照組比，②P<0.01;與西寧PDR組比，③P<0.05

2.4 兩種蛋白三維結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 利用3djigsaw及Ramol對(duì)ACSL5蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測及構(gòu)建，見圖2。

圖2 ACSL5蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測Figure 2 The Three dimensional structure prediction of ACSL5 protein

2.4.2 利用3djigsaw及Ramol對(duì)IGF蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測及構(gòu)建，見圖3。

圖3 IGF蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

Figure3TheThreedimensionalstructurepredictionofIGFprotein

3 討論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)入選人群的樣品中上述10個(gè)基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)只有ACSL5、IGF和CPS1 3種基因有明顯的差異，其他7個(gè)基因的變化不是很顯著，且文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，VEGF、OTC、TGF、ANGPTL4、HMGCS2、CTGF、PDK1研究較為廣泛[13-14]。因此，本文著重探討ACSL5、IGF和CPS1這3種基因與PDR的關(guān)系。

ACSL5基因，英文名為acyl-CoA synthetase long-chain family member 5，屬長鏈脂酰 CoA合成酶家族的一員，該基因催化飽和脂肪酸合成長鏈脂酰 CoA的位置主要位于C:12～C:22間，在磷脂、膽固醇脂和甘油三酯等的合成和脂肪酸的氧化中起著關(guān)鍵作用[15]。ACSL5基因定位于人類第10號(hào)染色體區(qū)域，在子宮、骨骼肌、腎臟、眼底血管等組織中均有表達(dá)[16]。

IGF基因，英文名為insulin growth factor，是一種能夠促生長作用的多肽分子，廣泛存在于人體各種組織中，在細(xì)胞增殖、組織器官的生長及創(chuàng)傷后修復(fù)、胰島素代謝、糖尿病視網(wǎng)膜病變等多種生理過程中均有表達(dá), 參與了多項(xiàng)重要的生理或病理過程[16]。研究表明，增生性視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞生長與IGF相關(guān)[17]。IGF在新生血管形成過程中，不僅能促進(jìn)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與分化，還能促進(jìn)凝血酶原激活物和氧自由基的釋放，激活纖溶酶原，降解視網(wǎng)膜微血管的基底膜，使血管內(nèi)皮細(xì)胞易于移動(dòng)，導(dǎo)致新生血管形成出現(xiàn)增生性視網(wǎng)膜病變[18]。

CPS1基因編碼氨基甲酰磷酸合成酶I(carbamoylphosphatesynthetase I)，該酶是一種線粒體基質(zhì)酶，負(fù)責(zé)催化肝臟鳥氨酸循環(huán)的第一步(催化氨分子和二氧化碳形成氨甲酰磷酸)，在蛋白質(zhì)和氮的代謝過程中起關(guān)鍵作用。

本研究通過對(duì)兩組RNA-Seq高通量數(shù)據(jù)進(jìn)行生物學(xué)信息學(xué)進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)了97個(gè)差異基因，對(duì)這些差異基因進(jìn)行GO富集分析、信號(hào)通路分析及蛋白相互網(wǎng)絡(luò)作用分析后，共篩選出來了10個(gè)潛在的與PDR相關(guān)的基因，其中CPS1、ACSL5表達(dá)下調(diào)，VEGF、IGF、TGF、OTC、ANGPTL4、CTGF、PDK1與HMGCS2表達(dá)上調(diào)。 我們通過檢測同一地區(qū)正常人群和PDR患者體內(nèi)3種基因核酸的相對(duì)含量，發(fā)現(xiàn)ACSL5、IGF和CPS1 3種基因與PDR密切相關(guān)。首先，無論在西寧地區(qū)(≤2500m)，或者高海拔地區(qū)(2500

4 結(jié)論

ACSL5、IGF和CPS1 3種基因與PDR密切相關(guān)，提示ACSL5、CPS1和IGF可能成為高原地區(qū)增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變的早期診斷指標(biāo)。但具體機(jī)理及臨床應(yīng)用還需通過大量實(shí)驗(yàn)及臨床病例深入探討。