劉艷華，任 彤，談艷苗，張利峰

（北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，北京 100026）

鮭 魚(yú) 甲 病 毒（Salmonid alphavirus，SAV）隸屬于披膜病毒科（Togaviridae）甲病毒屬（Alphavirus），是單股正鏈RNA病毒，基因組長(zhǎng)11～12 kb，含有兩個(gè)開(kāi)放閱讀框，具有5'端帽子和3'端polyA尾巴結(jié)構(gòu)[1]。目前發(fā)現(xiàn)鮭魚(yú)甲病毒有6種基因型（I、II、III、IV、V和VI型）[2]，主要感染大西洋鮭（Salmo salar）、虹鱒（Oncorhynchus raykiss）和褐鱒（S. trutta）等鮭科魚(yú)類(lèi)，引起鮭魚(yú)胰臟?。⊿almon pancreas disease，PD），主要表現(xiàn)為胰腺炎、心肌炎和昏睡等癥狀，其臨床癥狀和死亡率受水溫和季節(jié)的影響[3]。自1976 年首次在蘇格蘭養(yǎng)殖的大西洋鮭魚(yú)中報(bào)道發(fā)現(xiàn)PD以來(lái)，該病已在北美地區(qū)，以及挪威、愛(ài)爾蘭、法國(guó)和西班牙等歐洲國(guó)家被確診，致死率為1%～48%[4]。隨著冷水魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖的不斷發(fā)展和國(guó)際貿(mào)易的增加，SAV 有繼續(xù)擴(kuò)散的趨勢(shì)。2013 年世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將鮭魚(yú)甲病毒病列入法定通報(bào)的水生動(dòng)物疫病名錄。目前，SAV的檢測(cè)方法主要有細(xì)胞培養(yǎng)法[5]、ELISA方法[6]、RT-PCR[7]方法和RT-qPCR法[8]等。

為提高檢測(cè)效率，本研究以SAV保守基因片段為模板，設(shè)計(jì)LAMP引物，建立了一種SAV特異性的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Reverse transcription loop-mediated isothermal ampli fi cation，RT-LAMP）檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 病毒RNA

SAV RNA由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院提供。

傳染性鮭魚(yú)貧血病毒（Infectious salmon anaemia virus，ISAV）、病毒性出血性敗血癥病毒（Viral haemorrhagic septicaemia virus，VHSV）、傳染性造血器官壞死病毒（Infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV）、病毒性 神經(jīng) 壞死 病 病 毒（Viral nervous necrosis，VNNV）、草魚(yú)呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）、鯉春病毒血癥病毒（Spring viraemia of carp virus，SVCV）的RNA均由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.2 引物設(shè)計(jì)

以 SAV nsP1（GenBank：AY604238.1） 基因序列保守片段（181 bp）為模板，使用在線(xiàn)軟件 http∶//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html 和DNASTAR primer select 設(shè)計(jì)出3對(duì)引物（表1）。引物由上海生工有限公司合成。

1.3 反應(yīng)體系

表1 根據(jù)SAV nsP1基因片段設(shè)計(jì)的RT-LAMP引物

體系為25 μL：RNA模板5 μL，10×反應(yīng)緩沖液（含MgSQ480 mmol/L和dNTPs 14 mmol/L）2.5 μL，MgSQ4（100 mmol/L）1.5 μL，引物組（含SAV-FIP/BIP各16 μmol/L，SAV-F3/B3各2 μmol/L，SAV-LF/LB 各 4 μmol/L）各 2.5 μL，Bst 2.0 DNA聚合酶（8 000 U/mL）1 μL，AMV反轉(zhuǎn)錄酶1 μL（10 000 U/mL），去離子水11.5 μL。

1.4 反應(yīng)溫度優(yōu)化

以SAV RNA為模板，分別在58、59、60、61、62、63、64、65、67和 69 ℃ 下 進(jìn) 行 RTLAMP反應(yīng)。使用濁度儀LA-320C（Lanpu Biotech，China）讀取擴(kuò)增結(jié)果。

1.5 檢測(cè)結(jié)果可視化

在1.3反應(yīng)體系基礎(chǔ)上，加入終濃度10 mmol/L的鈣黃綠素，體系仍為25 μL。將PCR管放置于烘箱中，反應(yīng)溫度為1.4確認(rèn)的溫度，反應(yīng)時(shí)間為1 h，85 ℃滅活 5 min。

1.6 反應(yīng)產(chǎn)物克隆及陽(yáng)性對(duì)照制備

使用TIANgel Midi Puri fi cation Kit（TIANGEN，China）膠回收試劑盒，回收純化引物SAV-F3和SAV-B3的PCR擴(kuò)增片段，再將片段連接入pGem-T-Esay載體（Novigen），連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α中進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑選白色菌落提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒pGem-T-SAV作為RT-LAMP檢測(cè)用陽(yáng)性對(duì)照。使用微量紫外分光光度計(jì)，對(duì)重組質(zhì)粒溶液進(jìn)行定量，并按照以下公式將重組質(zhì)粒的質(zhì)量濃度換算為拷貝數(shù)濃度：

拷貝數(shù)濃度（copies/mL）=質(zhì)量濃度（g/mL）×6.02 × 1023/MW（g/mol）

1.7 檢測(cè)限

根據(jù)測(cè)量和換算的濃度，將重組質(zhì)粒pGem-T-SAV溶液稀釋為1011copies/μL，再將該溶液以10 倍梯度稀釋至 100、101、102、103、104、106、107copies/μL；每稀釋度各取5 μL分別進(jìn)行RTLAMP反應(yīng)和RT-PCR反應(yīng)。RT-LAMP反應(yīng)使用1.5的反應(yīng)體系和1.4確認(rèn)的反應(yīng)溫度，RT-PCR反應(yīng)使用OIE水生動(dòng)物疾病診斷手冊(cè)（2018）[9]推薦的RT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行。

1.8 交叉反應(yīng)

以 ISAV、VHSV、IHNV、VNNV、GCRV、SVCV的RNA為模板，各取5 μL分別進(jìn)行RTLAMP檢測(cè)（反應(yīng)體系和溫度同1.7）。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)溫度優(yōu)化

64、65和67 ℃組反應(yīng)26 min左右出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)，為最早出現(xiàn)曲線(xiàn)的反應(yīng)組，但67 ℃組的曲線(xiàn)線(xiàn)形不好；其他組擴(kuò)增曲線(xiàn)出現(xiàn)的時(shí)間較晚，69 ℃甚至顯示陰性。這有可能是當(dāng)反應(yīng)溫度超過(guò)65 ℃時(shí)，體系內(nèi)的反轉(zhuǎn)錄酶活性降低，使目的基因擴(kuò)增效率降低，導(dǎo)致RT-LAMP擴(kuò)增曲線(xiàn)吸光值較弱，甚至未檢測(cè)到信號(hào)。根據(jù)優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果，為提高引物與模板結(jié)合的特異性，RT-LAMP的反應(yīng)條件確定為65 ℃恒溫反應(yīng)1 h，85 ℃滅活5 min（圖1）。

圖1 SAV RT-LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化

2.2 檢測(cè)結(jié)果可視化

反應(yīng)體系內(nèi)加入鈣黃綠素后，檢測(cè)結(jié)果顯示，SAV呈綠色，其他樣品未變色（圖2）。

圖2 熒光RT-LAMP檢測(cè)SAV

2.3 檢測(cè)限

反應(yīng)條件為65 ℃恒溫反應(yīng)1 h，85 ℃滅活5 min。隨著樣品模板量的遞減，樣品變色時(shí)間也逐漸延長(zhǎng)，模板稀釋到10個(gè)拷貝數(shù)，PCR 擴(kuò)增1 h后的結(jié)果仍為陽(yáng)性；模板稀釋到100，即1拷貝數(shù)時(shí)，擴(kuò)增1 h后的結(jié)果則為陰性。由此可得出RT-LAMP檢測(cè)限為10個(gè)拷貝數(shù)的目的基因核酸片段（圖3）。

圖3 RT-LAMP檢測(cè)限

相對(duì)的，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，模板稀釋到102個(gè)拷貝數(shù)，結(jié)果為弱陽(yáng)性；模板稀釋到10個(gè)拷貝數(shù)，結(jié)果為陰性。因此RT-PCR的檢測(cè)限為102個(gè)拷貝數(shù)的目的基因核酸片段，RT-LAMP的檢測(cè)限是RT-PCR的10倍（圖4）。

圖4 RT-PCR檢測(cè)限

2.4 交叉反應(yīng)測(cè)試

交叉反應(yīng)測(cè)試結(jié)果表明，只有以SAV RNA為模板時(shí)，RT-LAMP的反應(yīng)才呈陽(yáng)性，而以其他病毒RNA為模板時(shí)，反應(yīng)結(jié)果則呈陰性，說(shuō)明建立的SAV RT-LAMP檢測(cè)方法特異性良好（圖5）。

圖5 RT-LAMP交叉反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

SAV對(duì)我國(guó)來(lái)說(shuō)是一種外來(lái)魚(yú)類(lèi)疫病病原，目前尚未分離到。隨著我國(guó)鮭科魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖面積的逐步增大[10]，以及國(guó)際鮭魚(yú)進(jìn)出口貿(mào)易量的不斷增加[11]，該病毒的傳入風(fēng)險(xiǎn)逐漸加大，因此必須加強(qiáng)針對(duì)SAV的檢驗(yàn)檢疫工作，避免SAV傳入我國(guó)[12]。在魚(yú)病的檢測(cè)工作中，樣品量往往非常大，導(dǎo)致檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。為減輕工作量、提高檢測(cè)效率，需要在保證檢測(cè)限和特異性的基礎(chǔ)上，建立比傳統(tǒng)的RT-PCR方法、RT-qPCR方法和免疫學(xué)方法更方便快捷的檢測(cè)方法。

環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增（Loop-mediated isothermal ampli fi cation，LAMP）可在1 h內(nèi)，將少量拷貝數(shù)的目的基因擴(kuò)增至109～1010個(gè)拷貝數(shù)，反應(yīng)產(chǎn)物不僅可以通過(guò)濁度儀、real-time PCR儀及凝膠電泳儀進(jìn)行檢測(cè)，而且還可以通過(guò)SYBR Green I、鈣黃綠素、羥基萘酚藍(lán)染色后，進(jìn)行肉眼識(shí)別[13]。因此近年來(lái)國(guó)內(nèi)外陸續(xù)建立了多種針對(duì)水生動(dòng)物病毒的LAMP檢測(cè)方法，如皰疹病毒II型[14]、傳染性造血組織壞死病毒[15]、真鯛虹彩病毒（RSIV）[16]等。

本研究建立的特異性SAV RT-LAMP檢測(cè)方法，將病原RNA的反轉(zhuǎn)錄與LAMP擴(kuò)增反應(yīng)集中于同一反應(yīng)體系，在恒溫條件下一次性完成擴(kuò)增。相對(duì)于傳統(tǒng)的方法，該方法主要有以下四點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：一是耗時(shí)短。RT-PCR方法檢測(cè)SAV，需要3 h左右，RT-qPCR方法需要2 h左右。該RT-LAMP方法省去了制備瓊脂糖凝膠、電泳等過(guò)程，反應(yīng)只需要1 h。二是恒溫即可完成整個(gè)檢測(cè)過(guò)程，不需要PCR儀或熒光定量PCR等設(shè)備，檢測(cè)成本較低。三是檢測(cè)限比目前通用的RT-PCR檢測(cè)方法高10倍。四是無(wú)需打開(kāi)反應(yīng)管電泳，降低氣溶膠擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)。作為一種高效的核酸擴(kuò)增技術(shù)，打開(kāi)反應(yīng)管取樣的過(guò)程中有一定氣溶膠污染風(fēng)險(xiǎn)[17]，容易導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性。該RT-LAMP檢測(cè)技術(shù)使用鈣黃綠色作為標(biāo)記物，使陽(yáng)性樣品可顯示肉眼可見(jiàn)的黃綠色，不需要打開(kāi)反應(yīng)管電泳等步驟，極大降低了氣溶膠擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)，可以有效避免核酸擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性[18]。

綜上所述，本研究建立的SAV RT-LAMP檢測(cè)方法，特異性強(qiáng)、檢測(cè)限高、快捷經(jīng)濟(jì)、假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)低，適合進(jìn)出口魚(yú)類(lèi)大批量樣品的臨檢工作。