凌 南，范漻鈺，任建鸞，曾德新，薛 峰，戴建君

（南京農業(yè)大學動物醫(yī)學院，江蘇南京 210095）

世界動物衛(wèi)生組織（OIE）定義的食源性人獸共患病是指通過食物在動物與人之間傳播的感染和疾病。2016年世界衛(wèi)生組織（WHO）發(fā)布的一份報告稱，每年至少有6億人，即全球1/10人口，因污染食物而患病，其中42萬人死亡，多為兒童、青少年；盡管5歲以下兒童僅占全球人口的9%，但他們卻占食源性疾病死亡人數(shù)的30%左右[1-2]。食源性細菌是食源性人獸共患病的主要病原，主要宿主是動物，其引發(fā)的重大動物傳染病嚴重影響了動物源性食品安全與獸醫(yī)公共衛(wèi)生，因此如何快速檢測病原對保障畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康具有十分重要的意義。活細菌擁有毒力及致病性，可對機體造成傷害，所以檢測病原菌的關鍵是區(qū)分活死菌以及致病和非致病菌[3]。對活菌的判定指標主要為：是否可培養(yǎng)，是否能新陳代謝從而形成產物，是否有完整的細胞膜。以下針對食源性人獸共患病的活菌檢測技術進行概括，并選擇實用性較強的PMA-qPCR檢測方法進行驗證。

1 活菌培養(yǎng)檢測技術

培養(yǎng)法是指在人為控制條件下，為特定微生物創(chuàng)造適宜的生長繁殖條件，從而達到特異性分離某種微生物的方法，被廣泛應用于食品中的病原菌檢測，是目前使用最廣泛，也是最經典的一種檢測手段?，F(xiàn)行食品安全國家標準中的細菌檢測大多采用培養(yǎng)法，如沙門氏菌（GB 4789.4）、單增李斯特氏桿菌（GB 4789.30）、溶血性鏈球菌（GB 4789.11）、副溶血性弧菌（GB 4789.7）等的檢測。培養(yǎng)法主要包括增菌、選擇性培養(yǎng)分離、生化鑒定等步驟，具有檢測靈敏度高、特異性強等優(yōu)點。培養(yǎng)法以得到活菌樣本為判定依據(jù)，具有極高的可信度，這也是其被廣泛應用于食源性人獸共患病病原檢測的重要原因。

然而，培養(yǎng)法周期長，一般要4～5 d，有的甚者達到7 d ；而且過程繁瑣，對檢測人員要求較高，檢測結果受人為因素影響大，在挑選可疑菌落環(huán)節(jié)易造成檢測結果不一致，甚者造成假陰性。周期長、過程繁瑣的檢測技術已經不適用于當前的社會發(fā)展形勢，不僅阻滯了食品流通，也會影響食品品質，從而造成巨大經濟損失。此外，培養(yǎng)法的檢測范圍有限，在低濃度水平下，對許多微生物的分離和鑒定都很困難[3]。某些細菌，如大腸桿菌、李斯特菌、綠膿桿菌等，可能會進入到一個“活的但不可培養(yǎng)”（VBNC）狀態(tài)，這種情況下更無法進行細菌培養(yǎng)。

2 活菌新陳代謝產物檢測技術

2.1 免疫學活菌檢測技術

免疫學活菌檢測技術是根據(jù)抗原抗體反應設計的活菌檢測方法。該方法是檢測機體產生的抗原、抗體、免疫細胞、細胞因子等。林賽君[4]利用酶聯(lián)免疫MINI-VIDAS法，檢測單核增生李斯特菌的準確度為99.6%，高于國標法的99.2%。免疫學技術具有敏感性強、準確性高、檢測速度快等優(yōu)點。但其假陽性率高，不能準確進行活菌定量檢測；單克隆抗體的制備較困難，容易產生交叉反應，存在抗體與非抗原物質之間的非特異性反應；靈敏度較低，需要經過必需的富集步驟。因此，在實際操作中，免疫學活菌檢測技術常常和其他技術聯(lián)合使用。

2.2 mRNA法

該方法利用逆轉錄酶對提取的RNA進行逆轉錄PCR，其原理是利用細菌轉錄物對胞內和胞外RNase降解敏感。mRNA水平在細胞死亡后快速下降，所以mRNA只存在于活細胞內，如大腸桿菌O157∶H7的RT-PCR測定[5]。但該方法存在一定缺陷：首先在逆轉錄PCR過程中，由于mRNA殘留的存在，會污染大量死亡細菌（104～107個/mL），從而產生假陽性結果；其次細胞中的RNA豐度和穩(wěn)定性不均一，并且存在一些RNA分子，其在喪失活力后也可以在細胞中持續(xù)存在較長時間；最后RNA容易降解，處理RNA需要的技術含量偏高。因此，該方法不太符合快速、簡便檢測的要求，僅適合于科研領域。

2.3 ATP生物發(fā)光法

ATP是活細胞中含量相對穩(wěn)定的一種代謝物，其生物半衰期較短，當細菌生長抑制或死亡后，菌體細胞內的ATP含量會明顯下降或消失，因此ATP依賴性的熒火蟲發(fā)光素酶（Fire fl y luoiferase）催化熒火蟲發(fā)光素（Fire fl y luciferin）氧化發(fā)光反應可作為活菌的檢測標志。利用反應發(fā)光強度和ATP呈正比的特性，可以得出樣品中的細菌數(shù)目。雖然該方法需要的試劑和實驗器材簡單并且檢測快速，但靈敏度較低，測定極限為1×10-13mol，約1×104CFU活菌數(shù)[6]。同時，ATP 生物發(fā)光法不能區(qū)分微生物ATP與非微生物ATP，并且樣品本身、ATP提取劑等含有離子。這些離子又會對ATP的測定造成干擾，抑制發(fā)光。因此，生物發(fā)光法只局限于總細菌數(shù)量的檢測，不能用于區(qū)分致病菌與非致病菌，這在很大程度上限制了生物發(fā)光法的普及應用。

2.4 指示劑法

細菌在代謝過程中產生的一些代謝產物能夠還原一些指示劑并使之變色，因而可通過顏色變化來判定待檢樣品中的細菌活性。該方法常用的指示劑主要有 CTC、INT 和刃天青鹽。無菌時指示劑顏色為母液顏色，而當有菌落時，指示液會被還原成紅色或者粉紅。Schaule等[7]將CTC偶聯(lián)熒光顯微鏡技術應用于飲水和生物膜中活菌的檢測，證明該偶聯(lián)技術可對活菌進行定量檢測。但是該方法使用的指示劑無法對細菌進行特異性染色，而且CTC存在一定的毒性，從而影響細菌的生長代謝。

2.5 生物傳感器

生物傳感器是對生物物質敏感并能將其濃度轉換為電信號的檢測儀器。Nanduri 等[8]應用生物傳感器檢測單核細胞增生李斯菌，檢測限為2×106CFU/mL。生物傳感器具有穩(wěn)定性好、選擇性強、靈敏度高、成本低等優(yōu)點，能在復雜體系中進行快速連續(xù)檢測。不同類型的生物傳感器具有各自獨特的優(yōu)點，但又存在各自的局限性。生物傳感器本身不能鑒定菌種，常常需要和其他的檢測方法聯(lián)合使用，為此基于免疫原理的生物傳感器成為當前的研究熱點。

2.6 噬菌體識別檢測技術

噬菌體是一種能夠侵入細菌并在宿主細菌體內進行增殖的病毒，具有拮抗細菌、裂解細菌的特性。噬菌體檢測技術的原理是利用噬菌體表達外源基因，將待選的基因片段定向插入噬菌體衣殼蛋白基因，通過親和富集法，篩選特異的蛋白質或多肽的噬菌體，從而識別生物毒素、細菌、孢子和病毒的抗體等?；谑删w開發(fā)的檢測技術具有能區(qū)分活死菌的優(yōu)點。Favrin 等[9]將該免疫磁性分離噬菌體擴增法用于肉湯中腸道沙門氏菌的檢測，發(fā)現(xiàn)檢出限達104CFU/mL。但由于噬菌體的一般宿主譜較窄，往往只對細菌某種血清型或分離株有特異性。

3 細胞膜完整性檢測技術

3.1 流式細胞術

流式細胞術（Flow cytometry，F(xiàn)CM）是在流式細胞儀基礎上，對處于快速直線流動狀態(tài)，且逐個通過光束的單個細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段。該技術能高速分析上萬個細胞，并能同時測量細胞的物理或化學性質。李影等[10]將流式細胞儀和熒光染色相聯(lián)合，對大腸桿菌的不可培養(yǎng)狀態(tài)進行試驗，發(fā)現(xiàn)當可培養(yǎng)菌數(shù)降為零時，與正常狀態(tài)細菌相比，誘導后菌株多數(shù)仍為呈現(xiàn)綠色熒光的活菌，活菌數(shù)遠遠超過死菌數(shù)，并且菌體形態(tài)多樣，每份樣品中至少存在兩種不同“顆?！?，結合熒光圖像可以確知桿狀、球狀或球桿狀菌體。由此表明，試驗菌株在可培養(yǎng)數(shù)為零時就已進入了VBNC狀態(tài)。流式細胞術和熒光染色的聯(lián)合運用可客觀評價細菌的活性狀態(tài)，能較準確分析出活死菌的數(shù)量或兩者數(shù)量的比例關系，但也存在一定缺陷。該方法雖能如實反映某一微生物區(qū)系中的細菌總數(shù)、存活狀態(tài)，以及活死細胞數(shù)量關系等，但卻無法鑒定和識別某一具體的微生物，尤其是處于VBNC狀態(tài)的細菌。此外，流式細胞儀分析樣品所需的熒光染料較多，劑量較大，價格昂貴，不適于大批量樣品檢測。

3.2 PMA/EMP-qPCR

該方法利用qPCR和生物染料PMA/EMA的結合，實現(xiàn)了檢測活死菌的目的。PMA/EMA與DNA結合的作用機制尚未完全闡明，可能是以下因素綜合作用的結果：（1）PMA/EMA不能通透細胞膜，只能選擇性地修飾死細胞“暴露”的DNA（細胞壁和細胞膜已破損的細胞）；（2）一旦進入細胞內，染料插入核酸中，在暴露于強可見光下，染料上的疊氮基團生成高反應性的Nitrene基，很容易在結合部位與碳氫化合物結合生成穩(wěn)定牢固的共價氮碳鍵，從而形成穩(wěn)定的DNA修飾；（3）該修飾強烈抑制PCR中的連續(xù)DNA擴增。因此，通過這種機制，EMA或PMA可以將死細胞優(yōu)選地嵌入DNA并防止死細胞隨后的DNA通過PCR擴增（圖1）[11]，而當PMA/EMA等核酸染料在強光作用下，同DNA偶聯(lián)結合，強光也會促使多余的核酸染料同水分子結合。剩余的羥胺（Hydroxylamine）不具有活性，因此完整細胞內的DNA在提取過程中不會受到核酸染料影響。經過核酸染料的鑒別，后續(xù)的PCR能特異性擴增，實現(xiàn)有效鑒別活菌的目的。

圖1 利用PMA染料選擇性檢測活菌的原理（源自 https∶//biotium.com/product/pmatm-dye-20mm-in-h2o/）

PMA/EMA -PCR檢測已被用于檢測食源性人獸共患病病原[12-14]。Andreas等[15]利用EMA對細菌進行預處理后，分別用微陣列技術和qPCR技術檢測活菌數(shù)，并對二者結果進行比較，發(fā)現(xiàn)兩種方法都可以有效檢測出樣本中的活菌含量，結果高度一致。

4 PMA-qPCR活菌檢測技術驗證

4.1 生物染料選擇

PMA為熒光染料PI的結構類似物，用于活死菌檢測時與EMA的作用原理相似，但是二者穿透細胞的能力有較大區(qū)別。盡管EMA/PMA作用機制相同，但相對來說，EMA在信號抑制方面比PMA效果好，而PMA在判斷活死菌的準確性上比EMA效果好。研究表明，EMA可穿透具有完整膜的細胞[16-17]。完整細胞攝取EMA的程度主要取決于細菌種類。這個問題對EMA的使用造成了嚴重限制。因此，對EMA的替代物PMA進行了研究[16]。研究表明，與EMA相反，PMA被有效地從具有完整細胞膜的細胞排除，這可能是由于正電荷的增加。它適用于廣泛的革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌，因此選擇PMA作為生物染料，構建PMA-qPCR檢測方法。

4.2 PMA-qPCR在副溶血性弧菌檢測中的應用

根據(jù)實驗室的研究基礎，建立針對副溶血弧菌PMA-qPCR活菌檢測技術，選擇toxR作為目的基因，設計引物及探針（表1）。

表1 以toxR為靶基因的PMA -qPCR探針引物

為了驗證PMA的效果，設計了4組試驗，分別是活菌（PMA）、活菌（W/O PMA）、死菌（PMA）、死菌（W/O PMA），細菌濃度為5×106CFU/mL，死菌用80 ℃處理。DNA用試劑盒（TIANamp Bacteria DNA Kit，DP302，TIANGEN）提取。W/O PMA組提取DNA后直接進行qPCR，PMA組用PMA處理，終濃度為10 μg/mL，充分混勻后在黑暗中處理3 min，再將菌液放置BLU-V system（QIAGEN）中在60光照強度下處理2 min，使PMA和DNA充分結合，再進行qPCR?？梢钥吹綕舛葹?.0×106CFU/mL時，PMA能夠充分抑制死菌的擴增，從而區(qū)分活菌和死菌（圖2）。

圖2 活菌和死菌的qPCR擴增

試驗數(shù)據(jù)表明，將PMA-qPCR結合，實現(xiàn)副溶血性弧菌活菌的快速檢測是可行的。在實際樣品檢測中可減少假陽率，所以將PMA應用于副溶血性弧菌的快速檢測具有很好的應用前景，針對不同食品基質中副溶血性弧菌的檢測也有待于學者們的進一步研究。近年來新型的LAMP環(huán)介導等溫擴增技術與PMA結合降低了對試驗器材的要求，雖然靈敏度略低于PMA-qPCR，但更簡單、經濟，特別適合資源有限的機構對病原體檢測的需要，商品化潛力更大。

5 小結

傳統(tǒng)培養(yǎng)法作為經典方法仍是目前食源性人獸共患病病原檢測的主要手段，但因其檢測周期長，與食品的高效流通產生了矛盾。以檢測新陳代謝產物為標準的活菌檢測技術雖然具有檢測速度快的優(yōu)點，但卻存在假陽性率高、檢測靈敏度低、操作技術要求高等弊端，僅適用于小范圍或某些特殊菌體的高效快速檢測。

目前以細胞膜完整性檢測為標準的活菌檢測技術主要有流式細胞術和EMA/PMA-qPCR檢測技術。它們同樣具有檢測速度快的優(yōu)點。流式細胞術雖能快速區(qū)分活死菌，但其需要大型儀器且檢測費用高，不具備區(qū)分菌種的功能，顯然也不適用于常規(guī)食品的病原菌檢測。PMA/EMA-qPCR檢測技術是建立在PCR技術基礎之上的，兼具檢測速度快、靈敏度高、特異性強、成本低等眾多優(yōu)點。PMA/EMA作為生物染料能巧妙排除死菌對PCR擴增的干擾，從而實現(xiàn)通過PCR技術快速檢測活菌的目的。目前該技術已被眾多學者應用于各種食源性人獸共患病病原活菌的快速檢測研究，其實際效果也得到了多數(shù)學者的肯定[12-16]。當然，也有學者指出PMA/EMA存在缺陷：PMA/EMA處理時的強光照射會對菌體造成殺傷；當PCR或qPCR的目的片段過短時，易造成PMA/EMA同目的片段結合疏漏，從而導致PMA/EMA對死菌DNA抑制不完全；菌液濃度過高或特殊的成團菌體形態(tài)會影響PMA/EMA的穿透力，從而影響PMA處理效果[17-19]。但這些缺點并非不能解決，對于強光引起高溫殺傷，可以在PMA處理中用冰浴對菌液降溫；對于小目的片段的影響，可以設計特異性強的引物或設計巢式PCR；對于菌液濃度及特殊菌體形態(tài)的影響，可以通過稀釋及濾膜過濾分解成團菌體。另外，對于濃度過低或復雜基質的情況，可以通過磁珠富集優(yōu)化；對于部分革蘭氏陽性菌細胞膜成分復雜的情況，可以用月桂基巰基乙酸（Sodium lauroyl sarcosinate）來增加PMA對死菌細胞膜的通透性[20-23]。在眾多學者的研究基礎之上，本實驗室以副溶血性弧菌活菌為檢測對象，對PMA-qPCR的活菌檢測效果進行了驗證，試驗數(shù)據(jù)表明，PMA的處理可以有效抑制濃度高達5.0×106CFU/mL的死菌，卻不影響活菌檢出。可見，PMA-qPCR用于食源性人獸共患活菌的快速檢測是可行的，其作為一種新型的活菌快檢手段，具有廣闊的應用前景。

此外，一種新型的鉑化合物也被證明可用于活菌檢測。鉑化合物主要用作有機化學中的催化劑，部分用作抗癌藥物，能有效穿透死菌，并與染色體DNA螯合。相比PMA/EMA，對可見光不太敏感的鉑化合物不需要光激發(fā)，而且價格低廉，可以代替EMA/PMA使用[16，18，24]，在比較苛刻的試驗環(huán)境下，如在典型實驗室（自然或者電燈實驗環(huán)境下）可以直接添加鉑化合物進行區(qū)分活死菌。然而，對該化合物的研究僅有少數(shù)報道，EMA/PMA-qPCR在食源性人獸共患病原菌活菌檢測技術中的廣泛應用以及鉑化合物在該檢測體系中的應用都有待于廣大學者進一步研究。