石 琴，袁立崗，蒲敬偉，沙 麗，柳 煒

（新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十二師畜牧獸醫(yī)工作站，新疆烏魯木齊 830009）

牛結(jié)核病是由牛型結(jié)核分支桿菌引起的一種人獸共患傳染病，奶牛最易感，水牛、黃牛、牦牛、鹿等多種動物也易感。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須報(bào)告的動物疫病，我國將其列為二類動物疫病。奶牛結(jié)核病是奶牛養(yǎng)殖中每年必檢的動物疫病。我國規(guī)定的奶牛結(jié)核病檢測方法有牛型結(jié)核分支桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)（GB/T 18645-2002）和外周血γ-干擾素體外釋放檢測（GB/T 32945-2016）。PPD檢測費(fèi)用低、敏感度高，但操作繁瑣、費(fèi)事費(fèi)力。γ-干擾素ELISA檢測試劑盒是外周血γ-干擾素體外釋放檢測法在實(shí)際中的應(yīng)用，與膠體金檢測方法同為通過采集牛血液進(jìn)行牛結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢測的方法，操作相對簡單。本試驗(yàn)先通過PPD進(jìn)行牛結(jié)核病普檢，然后對檢測結(jié)果再通過γ-干擾素和和膠體金方法進(jìn)行復(fù)檢，然后比對這2種檢測方法與PPD檢測方法的符合率，以探討各種檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為實(shí)際操作提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 采樣地點(diǎn)

新疆烏魯木齊市近郊兩個規(guī)?；膛?，共計(jì)存欄2 106頭。

1.2 檢測試劑

提純牛型結(jié)核菌素：哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司生產(chǎn)；牛結(jié)核γ-干擾素ELSIA檢測試劑盒：青島瑞爾生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；牛結(jié)核病抗體膠體金檢測卡：深圳市綠詩源生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.3 檢測方法

先對規(guī)模化奶牛場的2 106頭奶牛用PPD進(jìn)行普檢，對第1次檢疫的陽性牛和可疑牛過60 d后進(jìn)行復(fù)檢，如果仍為陽性，則判為結(jié)核病陽性牛。采集全部結(jié)核病陽性牛和部分陰性牛（隨機(jī)采集）抗凝血和全血進(jìn)行牛結(jié)核γ-干擾素ELISA試驗(yàn)和牛結(jié)核病膠體金檢測，并對結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3.1 牛型結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng) （PPD） 按照國家標(biāo)準(zhǔn)《動物結(jié)核病診斷技術(shù)》（GB/T 18645-2002）進(jìn)行操作，分別于注射前和注射后12、24和72 h測量皮膚厚度，并計(jì)算出皮厚差，按照國家標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。

1.3.2 牛結(jié)核γ-干擾素ELISA試驗(yàn) 采集抗凝血，8 h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室，按照說明書進(jìn)行檢測。

1.3.3 牛結(jié)核病膠體金檢測 將檢測卡恢復(fù)至室溫后，從密封鋁箔袋內(nèi)取出，放置于干燥平穩(wěn)桌面上，用所配吸管吸取待檢測血清3滴，加入檢測卡加樣孔中，15 min內(nèi)判讀結(jié)果。陰性：C線顯紅色條帶，T線不顯紅色條帶；陽性：C、T線均顯紅色條帶；無效：C線與T線均無紅色條帶出現(xiàn)或者C線無紅色條帶出現(xiàn)，但T線有紅色條帶出現(xiàn)。

2 結(jié)果

用PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)，對2個牛場2 106頭奶牛進(jìn)行普檢，對檢疫陽性和可疑牛經(jīng)過復(fù)檢，確診26頭牛為結(jié)核病陽性牛。陽性牛未表現(xiàn)明顯臨床癥狀。

采集26頭陽性?？鼓?、全血，分離血清，同時在2個牛場隨機(jī)采集結(jié)核病檢疫陰性牛血清20份，共計(jì)46份，進(jìn)行牛結(jié)核γ-干擾素ELISA檢測和牛結(jié)核病膠體金檢測。γ-干擾素ELISA檢測檢出陽性32份、陰性14份，膠體金檢測檢出陽性20份、陰性26份（表1）。

表1 3種方法的牛結(jié)核病檢測結(jié)果

據(jù)表1的檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)，PPD和γ-干擾素ELISA檢測相比，均為陽性的23頭，陽性符合率為88%（23/26），均為陰性的11頭，陰性符合率為55%（11/20）。PPD和膠體金檢測相比，均為陽性的19頭，陽性符合率為73%（19/26），均為陰性的19頭，陰性符合率為95%（19/20）。

3 討論

PPD（牛型結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)）是國際推薦的牛結(jié)核病診斷方法。其優(yōu)點(diǎn)是對人員的專業(yè)水平要求低（一般經(jīng)過簡單培訓(xùn)就能操作[2]），所需儀器設(shè)備簡單（僅需要卡介苗注射器和游標(biāo)卡尺），結(jié)核菌素抗原便宜，檢疫費(fèi)用較低，易于在基層推廣；缺點(diǎn)是該方法操作步驟多、繁瑣，費(fèi)時費(fèi)力，容易出現(xiàn)非特異性反應(yīng)，人為因素影響大，重復(fù)性差。

γ-干擾素ELISA試驗(yàn)主要是通過檢測牛感染牛分支桿菌后，機(jī)體通過細(xì)胞免疫產(chǎn)生的高水平IFN-γ含量的多少，來反映機(jī)體是否感染結(jié)核病[3]。其優(yōu)點(diǎn)是操作相對簡單、敏感性高，可檢測出早期感染牛，可以區(qū)分牛分支桿菌和副結(jié)核或禽分支桿菌感染，而且重復(fù)性好，易于標(biāo)準(zhǔn)化；缺點(diǎn)是采血后必須在8 h內(nèi)進(jìn)行[4]，試劑盒價格貴，成本高，需要酶標(biāo)儀，且對操作人員專業(yè)技術(shù)要求高，不利于在基層推廣使用。

抗體膠體金檢測法是對血清或血漿中牛結(jié)核分支桿菌抗體進(jìn)行檢測，操作簡便（僅需采血分離血清）、快速（15 min內(nèi)即可出結(jié)果），敏感性和特異性高，適合于在基層推廣；缺點(diǎn)是試劑盒較貴，檢測成本較高。

3種方法檢測均為陽性的16份，均為陰性的10份，總符合率并不高，僅為57%，說明每種檢測方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。γ-干擾素ELISA試驗(yàn)和PPD比較，陽性符合率最高（88%），說明其敏感性較高，可用于結(jié)核病早期感染的檢測。膠體金和PPD比較，陽性符合率為73%，陰性符合率為95%，說明特異性較高，可用于引種時的快速檢疫。

4 結(jié)論

通過檢測結(jié)果的對比，可以發(fā)現(xiàn)這3種方法符合率較低，每種檢測方法各有優(yōu)點(diǎn)：PPD試劑最便宜，費(fèi)用低，適合奶牛場結(jié)核病普檢；γ-干擾素ELISA試驗(yàn)敏感性較高，僅需抗凝血就可以進(jìn)行檢測，適合實(shí)驗(yàn)室診斷和結(jié)核病的早期診斷；膠體金檢測特異性較高，操作方便快捷，可以用于外購牛的結(jié)核病快速診斷。PPD仍為我國牛結(jié)核病檢疫國家標(biāo)準(zhǔn)，其它檢測方法都是輔助手段，因此在實(shí)際操作中，可以根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行相應(yīng)檢測方法的選擇。