吳志倉1，曹小安2，林學仕1，張俊文1，張麗蓉1，金淑霞1，王烈花1

（1. 永靖縣動物疫病預防控制中心，甘肅永靖 731600；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病原生物學國家重點實驗室，甘肅蘭州 730046）

布魯氏菌?。ㄒ韵潞喎Q布病）是我國的人乙類傳染病、家畜二類傳染病，也是世界衛(wèi)生組織（WHO）確認的致殘率最高的動物源性人獸共患病。畜間布病以牛羊為主，染疫家畜及其產(chǎn)品是人間布病的主要傳染源，牲畜養(yǎng)殖、畜產(chǎn)品加工、動物防疫和布病防治工作人員是高危人群。布病不僅危害人體健康，還阻礙畜牧業(yè)持續(xù)健康發(fā)展，嚴重影響社會穩(wěn)定和經(jīng)濟發(fā)展[1]。

最近幾年，布魯氏菌廣泛流行于我國大部分地區(qū)，特別是西北地區(qū)。布魯氏菌有多種血清型，其中羊主要感染馬耳他布魯氏菌3型，牛主要感染流產(chǎn)布魯氏菌1型和3型。豬布魯氏菌多在我國南方一些地區(qū)流行，北方比較少見[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，布病呈全國擴散趨勢，且流行菌株的特征發(fā)生了一些變化，如羊原來以馬耳他布魯氏菌1型感染為主，現(xiàn)在轉(zhuǎn)變?yōu)轳R耳他布魯氏菌3型[4-5]。因此，為查明永靖縣奶牛布魯氏菌病流行情況、感染菌種和類型，以便為布病防控提供技術(shù)支撐，2013-2017對永靖縣奶牛進行了連續(xù)5年的布病監(jiān)測，并對2016年檢出的布病陽性牛，采集病料進行了病原分離與鑒定。

1 材料與方法

1.1 監(jiān)測動物和樣品采集

對永靖縣劉家峽鎮(zhèn)、太極鎮(zhèn)、鹽鍋峽鎮(zhèn)、峴塬鎮(zhèn)、三塬鎮(zhèn)和西河鎮(zhèn)6個川塬區(qū)鄉(xiāng)鎮(zhèn)26個行政村農(nóng)戶中飼養(yǎng)的8月齡以上奶牛（懷孕后期奶牛為避免應急反應引起流產(chǎn)暫不檢測）進行采樣監(jiān)測。血清樣品采集，按常規(guī)無菌采血方法，空腹尾頸脈采血置于試管中，然后將試管擺成斜面，置于4 ℃冰箱，5 h后取出，放在室溫下待血清自然析出后收集血清；收集3份疑似感染布魯氏菌奶牛脾臟樣品，-20 ℃冷凍保存?zhèn)錂z。

1.2 試劑

Rnase A酶、Proteinase K和PCR反應酶等：購自于大連寶生物公司；BBLTM布魯氏菌肉湯培養(yǎng)基和布魯氏菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基選擇添加劑：購自于BD公司；SDS、酚-氯仿-異戊醇和引物等：來自于上海生工。無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 培養(yǎng)基制備

取BBLTM布魯氏菌肉湯 28 g、瓊脂15 g，加入蒸餾水或去離子水900 mL，調(diào)制到pH7.2，然后定容至1 L，攪拌加熱至完全溶解，121 ℃高壓滅菌15 min，待培養(yǎng)基溫度降至60 ℃左右時，加入50 mL無菌馬血清和新配制的布魯氏菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基選擇添加劑，混合均勻后制作布魯氏菌固體培養(yǎng)基平皿，備用。

1.4 血清學檢測

采集血清用虎紅平板凝集試驗（RBPT）初篩，對初篩檢測出的陽性奶牛血樣進行試管凝集試驗（SAT）。操作及結(jié)果判定標準，按照《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB/T 18646-2002）進行。

1.5 病原檢測

1.5.1 病料中基因組提取 取米粒大小脾臟放入離心管中，參照文獻[6]提取總基因組DNA：在離心管中加入 400 μL NET buffer、100 μL 20%的SDS（終濃度3.4%），混勻，95 ℃孵育10 min后，迅速放置于冰上冷卻；在樣品中加入Rnase A酶至終濃度為 75 μg/μL，50 ℃作用 2 h后，加入 proteinase K至終濃度為 325 μg/μL，50 ℃作用 2 h；在消化液中加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1），顛倒搖勻2～3次，4 ℃ 7 000 r/min離心10 min；轉(zhuǎn)移上清液于另一離心管中，重復用酚-氯仿-異戊醇抽提2次后，加入2.5倍體積的預冷無水乙醇，-20 ℃ 沉 淀 30 min，12 000 r/min離 心 10 min，棄取所有液相；用1 mL 70%乙醇漂洗2～3次，12 000 r/min離心2 min；真空或室溫干燥后，將DNA沉淀物用50 μL無菌雙蒸水溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 PCR檢測 參照文獻[6]，用布魯氏菌Nested-PCR 檢測病料中的細菌。一擴反應體系：ExTaq mix 25 μL，BP1和 BP2引物各 1μL，模板4 μL、無菌雙蒸水 19 μL；二擴：ExTaq mix 25 μL，BP3和BP4引物各1μL，一擴產(chǎn)物2 μL、無菌雙蒸水21 μL。一擴反應條件：95 ℃充分變性5 min，35個循環(huán)，分別為94 ℃變性1 min，49 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，72 ℃延伸10 min；二擴：20個循環(huán)，分別為94 ℃變性30 s，51 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，72 ℃延伸 6 min。1.6 細菌分離

取采集的病料100 mg左右放于1.5 mL離心管，加入500 μL無菌生理鹽水，用組織破碎儀破碎，5 000 r/min 離心10 min，無菌條件下將沉淀均勻涂布在選擇性培養(yǎng)基平皿。將涂布好的平板置37 ℃5%～10% CO2溫箱培養(yǎng)，每天觀察細菌生長情況，記錄生長菌落數(shù)量、顏色、大小、光滑度等。培養(yǎng)15 d后無細菌生長者為陰性。以接種針挑取選擇性培養(yǎng)平板單菌落，劃線接種于固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基，置37 ℃ CO2溫箱培養(yǎng)，觀察純培養(yǎng)細菌在固體和液體培養(yǎng)基的生長特性。

1.7 分離菌株AMOS-PCR檢測

AMOS-PCR 體 系：ExTaq mix 25 μL、AMOS-（A1）1 μL、AMOS-（M）1.5 μL、AMOS-（O）1.5 μL、AMOS-（S）1 μL、AMOS-（A2）1 μL、AMOS-（IS711）2 μL、DNA 模板 3 μL、ddH2O 14 μL。反應條件：95 ℃ 5 min，40 循環(huán)：94 ℃ 1 min，60 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1 min；最后72 ℃作用10 min。引物見表1。

表1 分離菌株AMOS-PCR檢測

1.6 分離菌株的omp25基因測序

為進一步鑒定分離菌株，選用該細菌保守的omp25基因作序列分析。用已知的序列引物擴增分離菌落的DNA，獲得omp25基因，將其克隆到pMD18-T載體上，送入測序公司測序。方法參照文獻[6]。將測序結(jié)果與已知公開的其它基因組序列用Mega軟件進行系統(tǒng)發(fā)生樹分析。

2 結(jié)果

2.1 血清學檢測

2013-2017年永靖縣共檢測奶牛1 431頭，檢出布魯氏菌病陽性奶牛64頭，平均個體陽性率為4.47%；共檢測奶牛群160個，檢出布魯氏菌病陽性牛群12個，平均群體陽性率為7.50%。其中：2013-2014年檢測奶牛444頭，未檢出陽性牛；2015-2016年檢測奶牛706頭，檢出陽性牛63頭，個體陽性率分別8.92%；2017年檢測281頭，檢出陽性1頭，個體陽性率為0.36%（表2）。對檢出的陽性牛全部進行了撲殺和無害化處理。

2.2 Nested-PCR 檢測

通過Nested-PCR 對樣本進行檢測，發(fā)現(xiàn)3份樣本均為布魯氏菌陽性（圖1）。

圖1 Nested-PCR 檢測結(jié)果

2.3 細菌分離鑒定

培養(yǎng)15 d內(nèi)，3份樣本中，只有1份生長出透明、光滑菌落。

2.4 分離菌株AMOS-PCR檢測

對分離獲得的1株細菌進行AMOS-PCR鑒定，結(jié)果擴增出流產(chǎn)布魯氏菌特征性條帶（圖2）。

2.5 分離菌株omp25基因測序與分析

omp25基因測序和系統(tǒng)發(fā)生樹結(jié)果表明，分離獲得菌株的omp25基因序列與已經(jīng)公布的基因序列高度一致，為流產(chǎn)布魯氏菌菌株特有序列（圖3、圖4）。

3 討論

圖2 AMOS-PCR鑒定結(jié)果

圖3 omp25基因測序結(jié)果

圖4 布魯氏菌omp25基因系統(tǒng)發(fā)生樹

永靖縣從1971年開始采取檢疫、撲殺病畜、免疫注射、治療病人等綜合防治措施防治布病，1983年達到了“控制區(qū)”標準，1995年達到了“穩(wěn)定控制區(qū)”標準[5]。 查閱1996-2014年永靖縣奶牛布病監(jiān)測記錄，發(fā)現(xiàn)該地連續(xù)18年未檢出陽性牛。而本次監(jiān)測在2015-2016年突然檢出63頭陽性牛，個體陽性率高達8.9%。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，這些病例主要是輸入性病例，檢測出的11個陽性奶牛群中，只有3個是自養(yǎng)牛群，其他全部是從周邊地區(qū)調(diào)入的，表明永靖縣的奶?！奥涞貦z疫”存在漏洞。

2017年永靖縣檢測奶牛281頭，檢出布魯氏菌病陽性1頭，個體陽性率下降到0.36%；檢測牛群35個，檢出陽性群1個，群體陽性率下降到2.86%，說明對檢出的布病陽性牛全部撲殺并進行無害化處理的措施效果明顯。今后，應當加大監(jiān)測頻次，每年至少開展2次奶牛布病檢測、1次飼養(yǎng)人員布病檢測。

最近幾年布病在我國再次流行，特別是在西北地區(qū)，由馬耳他布魯氏菌引起的羊布病流行嚴重，局部地區(qū)出現(xiàn)疫情暴發(fā)[7-8]。由于羊布病的廣泛流行，在西部地區(qū)，馬耳他布魯氏菌也成為牛布病的主要病原[9-11]。本研究經(jīng)細菌分離與鑒定發(fā)現(xiàn)，感染該地奶牛的布魯氏菌為流產(chǎn)布魯氏菌，說明永靖縣奶牛布病的感染源仍來自牛，無跨種傳播跡象。

4 結(jié)論

本研究對2013-2017年永靖縣8月齡以上奶牛進行了布病監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)該地奶牛布病個體陽性率呈現(xiàn)突然上升隨后下降趨勢，說明“檢測-撲殺”的布病防控措施效果明顯；對分離出的1株布魯氏菌菌株，通過AMOS-PCR檢測和opm25基因測序分析，鑒定為流產(chǎn)布魯氏菌，說明該地奶牛布病感染主要來源于牛。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，布病陽性病例主要是輸入性病例，說明需要加強牛只跨區(qū)移動的檢疫和監(jiān)管。