張 靜，范峻豪，劉春羽，趙 一，溫永俊，張七斤

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

羊口瘡（ORF）是由羊口瘡病毒（ORFV）感染山羊和綿羊引起的一種急性、接觸性傳染病，人偶有感染。本病以羊口唇、乳房等處的皮膚和粘膜形成紅斑、丘疹、膿瘡、潰瘍和結(jié)痂等為主要特征[1-2]。ORFV全基因組大小為135～139 kb，為雙鏈線性DNA病毒，基因組包含131個(gè)基因，其中B2L基因位于基因組的左末端。病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)增值時(shí)，B2L基因在病毒DNA尚未開始復(fù)制時(shí)便大量轉(zhuǎn)錄翻譯42 ku大小的蛋白。該蛋白是ORFV外囊膜的主要成分，可強(qiáng)烈刺激宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答[3-4]。

本研究截短表達(dá)了ORFV B2L基因，并依照大腸桿菌密碼子偏好進(jìn)行密碼子優(yōu)化，使其在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行融合表達(dá)，純化出高濃度重組蛋白，為后續(xù)建立ORFV血清學(xué)檢測(cè)方法提供了重要的抗原物質(zhì)，尤其是為建立ORFV間接ELISA方法奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Ni-NTA Agarose親和純化柱、Binding Buffer和Elution Buffer：購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；180 ku蛋白預(yù)染 Marker：購(gòu)自Thermo公 司；Anti-His Mouse mAb、100 ku蛋 白 預(yù) 染Marker：購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司；Anti-Mouse IgG：購(gòu)自SIGMA；PVDF膜：購(gòu)自Bio-Rad；蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BeyoECL Plus：購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞：購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。其他試劑均為標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)分析純?cè)噭?/p>

1.2 主要儀器

Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)印槽：美國(guó)Bio-Rad公司；Alph Imager HPr凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Protein Simple公司；雙垂直蛋白電泳儀：中國(guó)百晶生物公司；脫色搖床：中國(guó)五相儀器儀表公司。

1.3 B2L蛋白截短及密碼子優(yōu)化

運(yùn)用DNA Star中的Protean軟件，分析B2L蛋白的親水性、可塑性、蛋白表面可及性、抗原指數(shù)；根據(jù)分析結(jié)果截取抗原指數(shù)高、親水性好、可塑性好的片段進(jìn)行截短表達(dá)和密碼子優(yōu)化；將優(yōu)化好的片段送吉林庫(kù)美生物有限公司進(jìn)行合成，然后連接到pET32a（+）表達(dá)載體上，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中。

1.4 重組蛋白表達(dá)

將重組菌劃線接種于含Amp+的LB固體培養(yǎng)基37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，將過(guò)夜菌挑單菌落接種于3 mL含氨芐抗性的新鮮 LB液體培養(yǎng)基，搖菌培養(yǎng)12 h；按1%的比例將純化培養(yǎng)的菌液接種于200 mL含Amp+的新鮮LB液體培養(yǎng)基，37 ℃ 200 r/min震蕩培養(yǎng)；用分光光度計(jì)測(cè)A到0.6時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)；將菌液12 000 r/min離心10 min，棄上清，用Binding buffer洗滌2次，然后重懸，于冰浴中進(jìn)行超聲破碎（具體以超聲菌液清亮為止）；將超聲裂解菌液4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，分離上清和沉淀；將沉淀用尿素溶解，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳測(cè)定，并且以未誘導(dǎo)菌為陰性對(duì)照。

1.5 重組蛋白純化

將Ni-NTA Agarose親和純化柱加入5 mL Binding Buffer平衡10次，將蛋白加入平衡好的Ni-NTA鎳柱填料中，在冰上結(jié)合30 min；收集流穿液，加5 mL Binding Buffer洗滌1次，收集洗滌液，加Elution Buffer 5 mL洗1次，收集洗脫液。

1.6 重組蛋白Western-blot鑒定

將經(jīng)SDS-PAGE電泳的蛋白條帶轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，電壓14 V 1 h；用5%脫脂乳室溫封閉2 h，然后用10 mmol/L PBST洗3次，每次10 min；在膜上加入Anti-His Mouse mAb為一抗（1∶4 000稀釋），4 ℃過(guò)夜孵育，第2天用10 mmol/L PBST洗3次，每次10 min；再將膜放入1∶5 000稀釋的Anti-Mouse IgG中孵育1 h，取出膜后用10 mmol/L PBST洗3次，每次10 min；在PVDF膜上加ECL顯影液，放于熒光顯色儀中顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 B2L蛋白截短及密碼子優(yōu)化

2.1.1 B2L蛋白截短 利用DNA Star中的Protean軟件，分析B2L蛋白的親水性、可塑性、蛋白表面可及性、抗原指數(shù)等，選取抗原指數(shù)高、親水性好、可塑性好的片段進(jìn)行截短表達(dá)。分析結(jié)果見(jiàn)圖1-A，截取的目的蛋白氨基酸序列見(jiàn)圖1-B。

圖1 B2L蛋白的生物信息學(xué)分析

2.1.2 B2L蛋白截短基因的密碼子優(yōu)化 根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好進(jìn)行密碼子優(yōu)化，用E.coli Codon Usage Analyzer 2.1在線軟件分析優(yōu)化結(jié)果。結(jié)果顯示（圖2），優(yōu)化后的密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI）為1，且無(wú)稀有密碼子。CAI是反映編碼區(qū)同義密碼子與密碼子最佳使用相符合的程度，取值范圍在0～1之間，越高表明該基因的密碼子使用偏好性越強(qiáng)[7-8]。

圖2 密碼子優(yōu)化分析結(jié)果（CAI為1）

2.3 重組蛋白SDS-PAGE分析

將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)中，經(jīng)條件優(yōu)化，最終確定37 ℃ IPTG終濃度為1 mmol/L誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h后表達(dá)的效果最佳。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。從結(jié)果中可以看出，誘導(dǎo)的pET32a（+）-B2L重組菌超聲后上清及沉淀中的30 ku附近出現(xiàn)清晰條帶，而未誘導(dǎo)的PET-32a-B2L重組菌在這一位置沒(méi)有這一條帶，因此認(rèn)為B2L重組蛋白得到了成功表達(dá)。

圖3 SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果

2.4 重組蛋白純化

將誘導(dǎo)表達(dá)得到的B2L蛋白經(jīng)鎳柱親和層析后收集到的流穿液、洗滌液和洗脫液，分別取20 μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳，可以看出流穿液和洗滌液中也有 重組蛋白存在，但洗脫液中的重組蛋白單一，因而認(rèn)為重組蛋白得到較好的純化（圖4）。

圖4 SDS-PAGE電泳結(jié)果

2.5 重組蛋白Western-blot檢測(cè)

Western blot結(jié)果見(jiàn)圖5。純化的蛋白在30 ku附近出現(xiàn)1條清晰條帶，而未誘導(dǎo)的重組菌和誘導(dǎo)的空表達(dá)載體菌沒(méi)有出現(xiàn)目的條帶，表明重組蛋白在大腸桿菌中成功表達(dá)。

圖5 Western-blot結(jié)果

3 討論

目前，羊口疫廣泛流行于全球各羊養(yǎng)殖國(guó)家或地區(qū)，且發(fā)生頻率逐年上升，流行范圍逐漸擴(kuò)大，特別是我國(guó)黑龍江、新疆、內(nèi)蒙古、西藏、青海、吉林等養(yǎng)殖地區(qū)，近年頻頻暴發(fā)羊口疫疫情[5]，給養(yǎng)羊業(yè)造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)鑒于國(guó)內(nèi)缺乏相關(guān)檢測(cè)試劑盒，故應(yīng)給予羊口疫更高的關(guān)注。本試驗(yàn)通過(guò)PET-32a（+）表達(dá)載體構(gòu)建截短B2L重組表達(dá)質(zhì)粒，獲得了可溶性O(shè)RFV B2L蛋白，為將來(lái)建立間接ELISA檢測(cè)ORFV抗體提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，更為準(zhǔn)確診斷ORF和流行病學(xué)調(diào)查提供了簡(jiǎn)便快捷的方法[6-7]。

為了提高B2L重組蛋白的產(chǎn)量，在試驗(yàn)中通過(guò)對(duì)B2L基因優(yōu)化及截短，可以使蛋白得到更好的表達(dá)，且不失B2L蛋白的免疫原性。又通過(guò)表達(dá)條件的摸索和優(yōu)化，使用最佳條件，37 ℃ IPTG終濃度1 mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)3 h，最終蛋白得到了大量表達(dá)。