楊 沫，況作品，方文韜，謝曉梅

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 現(xiàn)代中藥安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012)

中藥中的有機(jī)酸是發(fā)揮臨床療效的重要活性成分[1-2]，主要包括脂肪酸、酚酸和萜酸等。文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，酚酸和萜酸類的分析檢測(cè)采用常規(guī)的反相高效液相色譜法[3-6]，而脂肪酸則更適合采用氣相色譜法，特別是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(gas chromatography and mass spectrometry，GC-MS)[7-8]。采用氣相色譜法檢測(cè)分析中藥中脂肪酸時(shí)，由于受到實(shí)驗(yàn)溫度下脂肪酸難以氣化的局限，所以一般需要對(duì)脂肪酸進(jìn)行衍生化處理。中藥樣品中脂肪酸衍生化應(yīng)用較為廣泛的是甲酯化法，主要有酸處理法、堿處理法、三氟化硼法等，優(yōu)缺點(diǎn)各異[9-12]。在文獻(xiàn)報(bào)道的甲酯化處理法中，有將樣品粉碎后直接加入甲酯化試劑進(jìn)行衍生化[13-14]；也有先提取樣品中脂肪酸成分，再加甲酯化試劑至提取物中進(jìn)行甲酯化[15-16]。不同樣品狀態(tài)下的甲酯化對(duì)中藥脂肪酸分析有何影響鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究考察了2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》(一部)收載的5種薔薇科果實(shí)類“味酸”藥材(木瓜、烏梅、山楂、覆盆子和金櫻子)，采用直接甲酯化和不同濃度乙醇提取后再甲酯化的供試品溶液制備方式，利用GC-MS同時(shí)測(cè)定多種脂肪酸，旨在為GC-MS測(cè)定中藥脂肪酸的樣品前處理選擇提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為5種藥材的脂肪酸表征和比較提供實(shí)驗(yàn)資料。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 7890B/5977A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent公司；BP211D電子天平：德國(guó)賽多利斯公司；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；Milli-Q Advantage超純水機(jī)：美國(guó)Millipore公司；氦氣(載氣，純度>99.999%)。

1.2 試藥 所測(cè)藥材樣品均購(gòu)自安徽省亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)周建理教授鑒定基原為薔薇科植物果實(shí)木瓜[Chaenomelesspeciosa(Sweet)Nakai]、烏梅[Prunusmume(Sieb.) Sieb. et Zucc.]、山楂(CrataeguspinnatifidaBge. var. major N. E. Br.)、覆盆子(RubuschinginHu)和金櫻子(RosalaevigataMichx.)。藥材經(jīng)60 ℃干燥后粉粹(過(guò)40 目篩)備用。所用試劑為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 儀器條件 參考文獻(xiàn)[16]并通過(guò)條件優(yōu)化建立本方法。色譜條件：HP-5MS石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；氣化室溫度280 ℃；柱溫：程序升溫，初始溫度40 ℃，保持3 min，40 ℃升至192 ℃(每分鐘4 ℃)，保持7 min，192 ℃升至280 ℃(每分鐘4 ℃)，保持5 min；分流進(jìn)樣，分流比10∶1；進(jìn)樣量1 μL；載氣：氦氣；流速：1 mL/min。質(zhì)譜條件：EI源，電離能量70 eV，溫度230 ℃；四級(jí)桿溫度150 ℃；發(fā)射電流100 mA；檢測(cè)電壓1.1 kV；檢測(cè)增益11.2；傳輸線溫度280 ℃；掃描質(zhì)量范圍：40～450 amu。溶劑延遲時(shí)間為2.9 min。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 直接甲酯化 參照文獻(xiàn)[17]并作優(yōu)化調(diào)整。取供試品粉末1.0 g，精密稱定；置50 mL試管中，加入H2SO4-CH3OH(1∶10)溶液20 mL，密閉，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，60 ℃恒溫水浴24 h；冷卻至室溫，上清液定量轉(zhuǎn)移至盛有20 mL水的分液漏斗中，再精密加入20 mL CH2Cl2，充分振蕩后靜置2 h，收集CH2Cl2層，經(jīng)飽和NaCl溶液洗滌后加5 g無(wú)水Na2SO4脫水，濾液即為供試品甲酯化溶液Ⅰ。

2.2.2 提取后甲酯化 參照文獻(xiàn)[15]并作優(yōu)化調(diào)整。取供試品粉末2.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，分別加入90%、50%乙醇溶液各40 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)60 min，濾過(guò)，濾液蒸干；殘?jiān)铀?0 mL，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至11.0，加入等容積石油醚并充分振蕩；取水層，用1 mol/L HCl溶液調(diào)pH至2.0，分別加入等容積乙酸乙酯、正丁醇萃取，有機(jī)相減壓回收溶劑；加H2SO4-CH3OH(1∶10)溶液20 mL置殘?jiān)?，按?.2.1”項(xiàng)下方法得供試品甲酯化溶液Ⅱ、Ⅲ。

2.3 供試品溶液的測(cè)定 取“2.2”項(xiàng)下制備的5種供試品各甲酯化溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，得各藥材3種甲酯化溶液GC-MS總離子流圖(見(jiàn)圖1)。采用NIST11數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)各甲酯化溶液Ⅰ的總離子流圖進(jìn)行譜庫(kù)檢索，依據(jù)相似度匹配并參考文獻(xiàn)，對(duì)相對(duì)面積大于0.1%的峰進(jìn)行成分辨識(shí)；利用面積歸一化法計(jì)算各峰相對(duì)含量。5種藥材主要脂肪酸成分測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

3 討論

HP-5MS彈性石英毛細(xì)管采用非極性的(5%-苯基)-甲基聚硅氧烷固定相，組分按照沸點(diǎn)高低依序出峰，一般小分子沸點(diǎn)低，保留時(shí)間短，分子量增大保留時(shí)間延長(zhǎng)。通過(guò)對(duì)薔薇科5種果實(shí)類藥材粉末直接甲酯化和經(jīng)提取后提取物甲酯化的不同樣品前處理方式比較，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果顯示出較大的差異。由圖1(AⅠ—EⅠ)可見(jiàn)，直接甲酯化可檢測(cè)出種類更多的脂肪酸，包括短鏈和長(zhǎng)鏈脂肪酸(C2—C24)。而提取后甲酯化的檢測(cè)結(jié)果與提取溶劑的極性大小有關(guān)，極性大有利于表征短鏈脂肪酸，如50%乙醇提取利于蘋(píng)果酸、檸檬酸等小分子多元酸(圖1中AⅢ—EⅢ)檢測(cè)；極性小有利于表征長(zhǎng)鏈脂肪酸，如90%乙醇提取利于油酸、亞油酸等高級(jí)脂肪酸(圖1中AⅡ—EⅡ)的檢測(cè)；5種藥材基本呈現(xiàn)同樣現(xiàn)象，顯示供試品制備方式對(duì)甲酯化檢測(cè)脂肪酸影響的規(guī)律性。鑒于溶劑極性對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，實(shí)驗(yàn)中對(duì)提取物衍生化反應(yīng)產(chǎn)物的提取也分別選擇了正丁醇和乙酸乙酯兩種不同極性的溶劑。為了便于顯示不同甲酯化方式對(duì)脂肪酸檢測(cè)的影響，本研究對(duì)總離子流圖縱坐標(biāo)示值作了歸一化處理。

注：Ⅰ.直接甲酯化；Ⅱ. 90%乙醇提取后甲酯化；Ⅲ. 50 %乙醇提取后甲酯化

圖1木瓜(A)、烏梅(B)、山楂(C)、覆盆子(D)和金櫻子(E)3種甲酯化方式的GC-MS總離子流圖

對(duì)能反映較多脂肪酸信息的直接甲酯化方式檢測(cè)圖進(jìn)行成分和相對(duì)含量分析，表1可見(jiàn) 5種藥材含脂肪酸種類和含量存在明顯差異，在種類上從大至小的順序?yàn)槟竟?相對(duì)含量大于0.10%有27種)、山楂(相對(duì)含量大于0.12%有19種)、金櫻子(相對(duì)含量大于0.13%有16種)、烏梅(相對(duì)含量大于0.20%有12種)、覆盆子(相對(duì)含量大于0.16%有12種)；5種薔薇科果實(shí)類藥材共有成分為蘋(píng)果酸、琥珀酸、檸檬酸等短鏈多元脂肪酸以及油酸、亞油酸和硬脂酸等高級(jí)脂肪酸；對(duì)于水溶性短鏈脂肪酸檢測(cè)結(jié)果與課題組前期HPLC分析結(jié)果趨勢(shì)基本相同，木瓜、烏梅和山楂富含蘋(píng)果酸或檸檬酸，而覆盆子和金櫻子各有機(jī)酸含量均較低[18]。值得一提的是本方法未能檢測(cè)到在5種藥材中較多存在的脂環(huán)族水溶性有機(jī)酸——莽草酸和奎寧酸。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)脂肪酸成分的檢測(cè)結(jié)果除了與衍生化方法、衍生化條件參數(shù)以及本實(shí)驗(yàn)考察的在相同衍生化方法中樣品不同物理狀態(tài)有關(guān)外，還與分析參數(shù)有關(guān)，如色譜柱程序升溫中初始溫度和升溫速度的設(shè)定以及質(zhì)譜的掃描質(zhì)量范圍；特別是初始溫度設(shè)定較高時(shí)不利于檢測(cè)到短鏈脂肪酸，如蘋(píng)果酸；程序升溫速度較快時(shí)不利于性質(zhì)相似組分的分離，如亞油酸和油酸。

表1 薔薇科5種果實(shí)類藥材主要脂肪酸成分相對(duì)含量測(cè)定結(jié)果

綜上，在相同的氣相色譜分離檢測(cè)條件下，不同樣品前處理方法對(duì)脂肪酸的檢測(cè)結(jié)果存在明顯差異。采用超聲波輔助H2SO4-CH3OH溶液一步提取衍生化(藥材粉末直接甲酯化)可較全面地同時(shí)了解短鏈和長(zhǎng)鏈脂肪酸成分的種類信息，是GC-MS測(cè)定中草藥脂肪酸方便快捷的甲酯化方法。