劉 剛，俞年軍，韓榮春，謝冬梅，劉路路，彭代銀，何祥林，張淇軍

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥資源保護與開發(fā)研究所，安徽 合肥 230012；2.霍山縣長沖中藥材開發(fā)有限公司，安徽 霍山 237266；3.霍山縣天下澤雨生物科技有限公司，安徽 霍山 237266)

霍山石斛藥材來源于蘭科植物霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)的新鮮或干燥莖，主產(chǎn)于大別山區(qū)，是安徽省珍稀、名貴、道地藥材之一。石斛入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。其味甘、平，主傷中，除痹，下氣，補五臟虛勞羸瘦，強陰，久服厚腸胃，輕身延年[1]?；羯绞剃幥鍩帷⒁嫖干?，其主要有效成分多為多糖、生物堿、氨基酸等物質(zhì)[2-8]。現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)多是以多糖和生物堿作為控制指標(biāo)，只對其單一的有效成分進(jìn)行定性和定量分析，難以全面反映霍山石斛藥材的整體特征[10]。本實驗建立了不同產(chǎn)地霍山石斛藥材的指紋圖譜，目的是研究不同產(chǎn)地的霍山石斛藥材質(zhì)量是否具有差異性，為控制和評價霍山石斛藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-16型高效液相色譜儀：日本島津公司；Eppendorf 5810R型離心機：德國Eppendorf公司；AS30600BT系列超聲波清洗儀：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；AB135-S型十萬分之一電子天平：德國梅特勒公司。

1.2 材料 13批霍山石斛藥材來源見表1，均經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)俞年軍教授鑒定為蘭科植物霍山石斛D.huoshanense。蘆丁(111876-201503)、石斛酚(111875-201202)：購自中國食品藥品檢定研究院；丁香酸(16041910)：購自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；甲醇為色譜純：瑞典Oceanpak公司；磷酸為分析純。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相甲醇(A)-0.2%磷酸水(B)；梯度洗脫(0～40 min，20%～50% A；40～45 min，50%～65% A；45～56 min，65%～70%A)；容積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長240 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 藥材烘干粉碎(過60目篩)，精密稱取0.5 g，置加塞玻璃瓶中，加入甲醇25 mL，稱質(zhì)量。室溫下超聲30 min，冷卻后稱定質(zhì)量，用甲醇補足損失的質(zhì)量，搖勻，0.22 μm濾膜濾過，得供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取蘆丁、石斛酚對照品適量，置1 mL溶液瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，溶解，0.22 μm濾膜濾過，得到濃度分別為1.6 mg/mL和0.2 mg/mL的混合對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度實驗 稱取同一批霍山石斛藥材(S1)，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液后，按“2.1”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以4號峰為參照，分別計算樣品中13個共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各共有峰的相對保留時間RSD<1.70%，相對峰面積RSD<2.30%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性實驗 稱取同一批霍山石斛藥材(S1)，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液后，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，分別考察13個共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各共有峰的相對保留時間RSD<1.60%，相對峰面積RSD<1.38%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性實驗 平行稱取6份同一批霍山石斛藥材(S1)，按“2.2.1”項下方法制備6 份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行分析，考察各共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果相對保留時間RSD<1.80%，相對峰面積RSD<2.18%，該方法重復(fù)性良好。

2.4 結(jié)果與分析

2.4.1 指紋圖譜的建立 將13批霍山石斛藥材按“2.2.1”項方法制備供試品溶液，再按“2.1”色譜圖條件進(jìn)行分析，得到各批次霍山石斛藥材圖譜。將圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012)，設(shè)S4為參照圖譜，選擇中位數(shù)法作為對照指紋圖譜的生成方法，見圖1。時間窗寬度為0.1，采用多點校正方法對色譜峰進(jìn)行全譜峰匹配，生成指紋圖譜共有模式和對照品圖譜R，見圖2。并計算不同年限霍山石斛與對照圖譜的相似度，見表2。

圖1 霍山石斛藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜

圖2 13批霍山石斛HPLC指紋圖譜與共有圖譜R(4.蘆丁 7.石斛酚)

S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13RS11 S20.843 1 S30.695 0.906 1 S40.704 0.893 0.981 1 S50.890 0.977 0.883 0.866 1 S60.945 0.939 0.752 0.747 0.956 1 S70.956 0.918 0.768 0.761 0.944 0.978 1 S80.914 0.885 0.842 0.841 0.914 0.906 0.950 1 S90.932 0.924 0.882 0.885 0.941 0.911 0.932 0.954 1 S100.919 0.848 0.816 0.812 0.871 0.872 0.927 0.979 0.949 1 S110.958 0.915 0.830 0.824 0.936 0.948 0.977 0.978 0.967 0.979 1 S120.825 0.858 0.800 0.792 0.863 0.867 0.906 0.940 0.851 0.932 0.933 1 S130.666 0.868 0.983 0.985 0.833 0.697 0.713 0.802 0.875 0.786 0.790 0.726 1 R0.902 0.960 0.927 0.925 0.964 0.924 0.943 0.969 0.979 0.950 0.974 0.917 0.898 1

2.4.2 峰的確認(rèn) 根據(jù)指紋圖譜中14個共有峰與對照品溶液色譜圖的比對，確認(rèn)其中4號峰和7號峰分別是蘆丁和石斛酚。由圖1可知4號峰蘆丁出峰時間居中、峰面積適中、分離度好、在各樣品中均存在，故選取4號峰蘆丁為參照峰。

3 結(jié)果分析

3.1 相似度結(jié)果分析 由表2可知，栽培品霍山石斛藥材(S1～12)相似度計算結(jié)果均大于0.900，表明不同產(chǎn)地大棚栽培的霍山石斛藥材質(zhì)量具有較好的一致性。仿野生(S13)霍山石斛藥材相似度為0.898，略小于0.900，說明仿野生霍山石斛藥材與栽培品霍山石斛藥材在質(zhì)量上差異不大。建議給出相似度閾值為0.900，以0.900為閾值可以將13批樣品分為2類，第一類為栽培品霍山石斛藥材，第二類為仿野生栽培霍山石斛藥材。

3.2 聚類分析 利用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件將13批藥材中14個共有峰相對峰面積進(jìn)行聚類分析，選用歐式距離平方作為樣品間相似度距離，采用組間連接聚類法進(jìn)行分析，結(jié)果見圖3。從圖3中可以看出13批霍山石斛藥材被大致分為3類，其中S2、S3、S4為一類，S5、S6為一類，S1、S7—S13為一類。結(jié)果說明同一產(chǎn)地的霍山石斛藥材質(zhì)量較為均一，而不同產(chǎn)地的霍山石斛藥材由于其栽培模式(種源、栽培基質(zhì)、藥材加工方法、采收時間等)的不同而導(dǎo)致其化學(xué)成分(1、3、4、6、9號峰所對應(yīng)的化學(xué)成分)含量具有差異性。

3.3 霍山石斛藥材共有峰主成分分析 將14個共有峰相對峰面積導(dǎo)入SPSS 19.0軟件，以主成分分析為提取方法，提取了3個最主要成分，結(jié)果見表3。前3個是最主要的主成分，第一主成分的特征值為6.775，方差貢獻(xiàn)率為52.115%；第二主成分的特征值為2.183，方差貢獻(xiàn)率為16.795%；第三主成分的特征值為1.226，方差貢獻(xiàn)率為9.434%，這3個主成分的方差累計貢獻(xiàn)率達(dá)到78.344%，這3個主成分已足夠代表霍山石斛藥材所含化學(xué)成分的絕大多數(shù)信息。對3個主成分貢獻(xiàn)率較高的成分分別是1、3、4、6、9號峰所對應(yīng)的成分，結(jié)合圖4的分析結(jié)果，認(rèn)為1、3、4、6號峰所對應(yīng)的化學(xué)成分是影響霍山石斛藥材質(zhì)量的重要化學(xué)成分。

圖3 13批霍山石斛藥材的樹狀圖

3.4 霍山石斛藥材載荷圖分析 將樣品共有峰面積導(dǎo)入SIMCA-P(11.0)中，以SIMAC為主成分分析方法，以PCA on X-block模型對14個共有峰峰面積進(jìn)行分組[9]。主成分載荷圖見圖4。由圖4可知，指紋圖譜中對聚類分析起主要作用的色譜峰為1號峰、3號峰和4號峰，其中4號峰為蘆丁，剩下2個峰所對應(yīng)的化學(xué)成分還需要進(jìn)一步的研究。

4 討論

隨著霍山石斛組培快繁技術(shù)的建立，并且成功應(yīng)用于大規(guī)?；纳a(chǎn)，每年能產(chǎn)出數(shù)億株霍山石斛種苗[10]。但是霍山石斛的發(fā)展仍然面臨著引種種源的混亂,假冒、摻偽藥材的收售,相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不健全等問題。本實驗通過建立13批霍山石斛藥材HPLC指紋圖譜，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法，以14個共有峰峰面積進(jìn)行統(tǒng)計分析，指認(rèn)出其中2個色譜峰，分別是蘆丁和石斛酚。實驗中還對丁香酸進(jìn)行了指認(rèn)，由于在樣品中含量僅為0.02%，故未在共有峰中指出。相似度分析結(jié)果顯示，栽培品霍山石斛藥材與仿野生霍山石斛藥材的質(zhì)量較為接近，說明大棚栽培模式下霍山石斛在一定程度上可以替代仿野生栽培的霍山石斛。

表3 13批霍山石斛藥材的主成分分析

圖4 13批霍山石斛藥材載荷圖

雖然3年生大棚栽培品霍山石斛和仿野生栽培霍山石斛藥材的質(zhì)量較為均一，但在個別化學(xué)成分含量上差異較為顯著。在聚類分析和主成分分析中，13批霍山石斛藥材被分為3類，這是因為各產(chǎn)地霍山石斛藥材中化學(xué)成分含量具有差異性，結(jié)合主成分分析結(jié)果，1、3、4、6號峰所對應(yīng)的化學(xué)成分是影響各批次霍山石斛藥材質(zhì)量的主要因子。因此，下一步實驗應(yīng)指認(rèn)這4個峰對應(yīng)的具體化學(xué)成分，在霍山石斛藥材質(zhì)量控制上重點考察這4個化學(xué)成分。