李珉，張莉，余婷婷，范志勇

（湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術研究中心，湖北武漢 430000）

維生素 A、D、E極性較弱不溶于水，易溶于有機溶劑，屬于脂溶性維生素(Fat Soluble Vitamins)，是人體必需的營養(yǎng)素，在食品及保健食品領域的研究和應用非常廣泛。食用油脂中天然脂溶性維生素含量高低是評價油品品質(zhì)和營養(yǎng)價值的重要參數(shù)，維生素A、D作為營養(yǎng)強化劑用于食用油中可提高其營養(yǎng)價值，維生素E在油脂加工中作為天然抗氧化劑防止油脂氧化，保障油品品質(zhì)。保健食品中以油脂為載體加入維生素A、D、E用以預防夜盲癥、佝僂病和抗衰老等[1]。然而，脂溶性維生素在高溫、高濕、光照、和極端pH值條件下易發(fā)生轉(zhuǎn)化，若在食品加工儲存環(huán)節(jié)流失嚴重，則無法達到預期的營養(yǎng)強化目的。同時脂溶性維生素的過量攝入還存在著蓄積中毒的風險，如維生素A攝入過量可能導致胎兒畸形、維生素D攝入過量可能引起低熱驚厥、維生素E攝入過量可能導致出血傾向并影響機體免疫功能[2]。因此，實現(xiàn)快速準確地定性定量分析油脂性食品中的維生素 A、D、E能夠為油脂性食品質(zhì)量安全監(jiān)管及油脂抗氧化新工藝研究提供技術支持[3～5]。我國現(xiàn)行的檢測方法標準[6～8]，國內(nèi)[9～12]和國外[13～16]的研究表明，目前應用最為廣泛的脂溶性維生素A、D、E的測定方法為皂化后液液萃取-液相色譜法，其中僅維生素D有現(xiàn)行國家標準方法可通過皂化后液液萃取后由質(zhì)譜檢測器檢測結合內(nèi)標法定。皂化后液液萃取法優(yōu)點，一是樣品凈化較為徹底，二是統(tǒng)一了脂溶性維生素的檢測形式；但操作步驟繁雜、耗時長，無法實現(xiàn)快速批量檢測，同時過多的前處理操作環(huán)節(jié)極易影響結果的精密度。凝膠滲透色譜（Gel Permeation Chromatography，GPC）可用于對復雜基質(zhì)樣品中脂肪、色素和蛋白質(zhì)等大分子干擾物質(zhì)的處理凈化，能夠顯著提高前處理的效率和結果的精密度[17]。質(zhì)譜檢測作為高靈敏度的定量檢測技術，十分適用于油脂性食品中脂溶性維生素的精準定性和定量[18～22]。

本實驗采用 GPC技術對油脂性食品進行自動化的前處理，采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜同時測定脂溶性維生素A、D、E，從而顯著提高油脂性食品中脂溶性維生素檢測方法的分析效率。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器設備

乙酸乙酯（色譜純），Merck公司；甲醇（色譜純）、甲酸（優(yōu)級純）、乙酸銨（優(yōu)級純）、視黃醇標準樣品（純度95%），SIGMA-ALDRICH公司；視黃醇醋酸酯標準樣品（純度99.9%），Supelco公司；DL-α-生育酚標準樣品（純度99.0%），Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；維生素D2標準樣品（純度99.1%），Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；維生素 D3標準樣品（純度 98.9%），Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

MS205DU電子天平，梅特勒-托利多；Elmasonic S180H超聲儀，Elma Hans Schmidbaner GmbH &Co.KG公司；Preplinc GPC+Accu Vap凝膠凈化滲透色譜儀，J2 Scientific公司；配備紫外檢測器、分離色譜柱PT785 Bio-BeadsS-X3（填料質(zhì)量50 g）、環(huán)己烷（色譜純），Merck公司；TSQ Quantum Access Max液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，Thermo公司；配有電噴霧電離源(ESI)，Thermo Xcalibur質(zhì)譜工作站；Milli-Q Reference超純水器，美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 配制標準溶液

分別準確稱量視黃醇、視黃醇醋酸酯、DL-α-生育酚、維生素D2、維生素D3標準樣品5 mg、5 mg、10 mg、10 mg、100 mg至10 mL棕色容量瓶中，精確至0.1 mg，加甲醇超聲溶解后定容至刻度，作為標準儲備溶液，于-4 ℃避光儲存。

1.2.2 儀器條件

1.2.2.1 凝膠色譜條件

分離色譜柱：PT785 Bio-BeadsS-X3（填料質(zhì)量50 g）；流動相：環(huán)己烷-乙酸乙酯（5：5，V/V）溶液，流速：5 mL/min，進樣量：5 mL；洗脫時間：（0～15）min、收集流出液時間：（15～35）min、清洗時間：（35～45）min。

1.2.2.2 色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil GOLD（2.1 mm×100 mm，粒徑 3 μm）；柱溫：35 ℃；進樣體積：10 μL；流速：0.4 mL/min；流動相：A：甲醇、B：0.1%甲酸5 mmol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫程序：（0～1）min，50%A；（1～3）min，50%～95%A；（3～9）min，95%A；（9～10）min，95%～50%A；（10～11）min，50%A。

1.2.2.3 質(zhì)譜條件

圖1 各脂溶性維生素MRM色譜圖Fig.1 Multiple reaction monitoring chromatograms of fat soluble vitamins

離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子模式；監(jiān)測方式：多反應監(jiān)測(MRM)；噴霧電壓：3800 V；霧化器溫度：200 ℃；鞘氣壓力：40 psi；輔助氣：15 psi；毛細管溫度：350 ℃。

定性離子、定量離子及對應的碰撞能量、噴霧電壓參數(shù)見表1。圖1為各脂溶性維生素MRM色譜圖，其中視黃醇出峰時間為4.00 min，視黃醇醋酸酯出峰時間為4.48 min，維生素D2出峰時間為5.92 min，維生素D3出峰時間為6.00 min，維生素E出峰時間為6.81 min。

表1 脂溶性維生素的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 MS/MS parameters for fat soluble vitamins

1.2.3 樣品處理

油脂性食品：稱取0.3～0.5 g試樣于10 mL刻度離心管中，在避光條件下，加入環(huán)己烷-乙酸乙酯（5：5，V/V）溶液定容至10 mL刻度線，渦旋震蕩2 min，提取液用0.22 μm有機濾膜過濾后按照1.2.2.1項方法用凝膠色譜凈化，流出洗脫液濃縮定容到1 mL待分析。

脂溶性維生素混和標準使用溶液：吸取標準儲備液各200 μL于10 mL棕色容量瓶中，在避光條件下混勻后用環(huán)己烷-乙酸乙酯（5：5，V/V）溶液定容至刻度，提取液用0.22 μm有機濾膜過濾后按照1.2.2.1項方法用凝膠色譜凈化，流出洗脫液濃縮定容1 mL待分析。

2 結果與討論

2.1 GPC分離條件的確定

油脂樣品主要由高級脂肪酸的甘油酯組成，其分子量通常在 800以上，而脂溶性維生素的分子量在250～450之間。GPC技術是基于空間排阻的原理根據(jù)分子量大小的不同進行分離，因此本實驗采用GPC為凈化手段。可能對分離效果產(chǎn)生影響的主要因素包括色譜柱類型、柱容量、流動相流速、流動相組成和比例。商品化的凝膠滲透色譜柱通常規(guī)定了允許使用的流動相組成和比例，故本實驗主要考慮的條件優(yōu)化因素為色譜柱類型、色譜柱容量和流動相流速。

理論上，色譜柱容量越大、流動相流速越慢越能夠改善混合物的分離度，但實際操作時還要考慮檢測工作的時效性，因此通過交互設計，對兩種不同長度的色譜柱在三種流速下分別進行試驗，結果如下：

（1）以環(huán)己烷-乙酸乙酯（5：5，V/V）溶液作為流動相，選擇兩種常用長度的色譜柱，分離色譜柱1：Express GPC cleanup column（填料質(zhì)量20 g）、分離色譜柱2：PT785 Bio-BeadsS-X3（填料質(zhì)量50 g），分別比較流速1（5 mL/min）、流速2（3 mL/min）、流速3（2 mL/min）三種不同流速下的脂溶性維生素與大豆油的分離度，在可接受的分離度下比較總分析時間，選擇合適分離度條件下分析時間最短的條件作為最佳方案。當分離度為0.8時，相鄰兩組分可達到95%的分離度，完全滿足凈化油脂的需要，本實驗擬將分離度達到0.8作為可以接受的分離度。表2為分離度與總分析時間情況，綜合考慮分離度和總分析時間指標，試驗1和試驗2的分離度小于0.8，無法滿足凈化油脂的需求，試驗3、試驗4、試驗5、試驗6的分離度均大于0.8，且試驗4所用分析時間最短，故選擇試驗4為以大豆油為基體分離脂溶性維生素的最佳分離方案。

分離度計算公式：R=2(t2-t1)/(W1+W2)

注：t2：相鄰兩峰中后一色譜峰的保留時間；t1：相鄰兩峰中前一色譜峰的保留時間；W1、W2：此相鄰兩峰的峰寬。

圖2 最佳分離條件下脂溶性維生素混合標準樣品和不同油脂樣品的GPC圖譜Fig.2 GPC chromatograms of fat soluble vitamins mixed standard samples and different oil samples at the optimal separation conditions

（2）采用以上最佳分離條件對其他油脂樣品如大豆油、動物油（黃油）、維生素 E軟膠囊、魚肝油軟膠囊進行分離度的測試，通過試驗由圖2可見，脂溶性維生素混合標準物質(zhì)在15 min后流出，而大豆油、動物油（黃油）、維生素 E軟膠囊、魚肝油軟膠囊中的油脂成分均在15 min前出峰流出，二者分離度均在0.8以上，結果表明該條件能夠?qū)⑵渌贩N油脂樣品和脂溶性維生素進行很好地分離，滿足實驗需求，故選擇15 min～35 min收集流出液。

表2 分離度與總分析時間Table 2 Resolution and total analysis time

2.2 色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動相的優(yōu)化

分別選擇甲醇-甲酸水和乙腈-甲酸水作為流動相，試驗表明：當以乙腈作為流動相時，其洗脫能力較強，視黃醇和視黃醇醋酸酯在液相部分難以分離；二者母離子和碎片離子信息完全一致，在質(zhì)譜部分也無法分離；同時發(fā)現(xiàn)在乙腈條件下各標準樣品的離子化程度均受到一定程度的抑制，且維生素 D3無法檢測，以甲醇作為流動相時的檢測靈敏度提高2個數(shù)量級，且所有脂溶性維生素均可檢測，故選擇以甲醇作為流動相。本實驗為正離子掃描模式，嘗試在流動相中加入甲酸、乙酸銨以提高離子化效率及改善峰型，試驗表明，0.1%的甲酸、5 mmol/L的乙酸銨體系能提供最佳離子化條件。

2.2.2 離子源選擇

電噴霧離子源（ESI）是最常用的液相離子源，適用于極性較強的化合物，可用于熱不穩(wěn)定化合物的分析大氣壓化學電離源（APCI）適用于中等極性或弱極性的小分子量化合物，尤其是含雜原子的化合物，不適合熱不穩(wěn)定或在溶液中容易電離的化合物。雖然ESI源是常用的離子源，但由于脂溶性維生素極性較弱，從原理上可能APCI源具有更好的電離效果，故對兩種離子源進行對比試驗，結果表明APCI源在分析維生素D2和D3時比ESI源具有更高的靈敏度，但對維生素A和維生素E的分析不如ESI源，考慮到ESI源的通用性，本實驗選擇ESI源。

2.2.3 母離子確定

視黃醇是一個具有脂環(huán)的不飽和一元醇，其分子量為286.45，正離子掃描下理論分子離子峰應為287，在研究質(zhì)譜方法的過程中，未找到287的母離子。根據(jù)經(jīng)驗，脂肪族醇、胺、腈類及多支鏈化合物容易裂解，分子離子峰通常很弱或不出現(xiàn)，因此判斷視黃醇在分析過程中可能發(fā)生了源內(nèi)裂解，分析其分子結構，其容易發(fā)生脫氫重排脫去一分子水，形成質(zhì)荷比為269的脫水峰，經(jīng)試驗，證實了這一判斷，同時發(fā)現(xiàn)視黃醇醋酸酯也發(fā)生了同樣的反應。

2.3 方法學實驗

2.3.1 方法檢出限和線性范圍取濃度分別為5、20、50、100、200 μg/L的系列標準溶液，以峰面積A對相應的質(zhì)量濃度C進行線性回歸，結果表明：視黃醇、視黃醇醋酸酯、維生素D2、維生素D3、維生素E在5～200 μg/L的濃度范圍內(nèi)均

具有良好的線性關系，相關系數(shù)r均在0.999以上。按3倍信噪比計算得到樣品中視黃醇、視黃醇醋酸酯、維生素D2、維生素D3、維生素E的檢出限分別為2

μg/kg、1 μg/kg、5 μg/kg、2 μg/kg、10 μg/kg。

2.3.2 方法回收率

在不含有脂溶性維生素的大豆油基質(zhì)中添加脂溶性維生素混合標準樣品溶液，使大豆油中各脂溶性維生素含量為10.0、20.0、50.0、100.0 μg/kg；由于油脂中普遍含有維生素E，故維生素E回收率采用試劑空白加標進行測試。

按1.2方法進行預處理，表3為各脂溶性維生素回收率結果。結果表明：視黃醇的回收率在97.0%～102.3%；視黃醇醋酸酯的回收率在98.1%～102.3%；維生素D2的回收率在96.3%～106.6%；維生素D3的回收率在96.7%～103.2%；維生素E的回收率在93.1%～99.1%。

表3 各脂溶性維生素回收率結果Table 3 Results of recoveries of fat soluble vitamins

2.3.3 方法精密度

在不含有脂溶性維生素的大豆油基質(zhì)中添加脂溶性維生素混合標準樣品溶液，使大豆油中各脂溶性維生素含量為20.0 μg/kg，維生素E采用試劑空白加標進行測試。

按 1.2方法進行預處理，平行處理 6次，進行LC-MS/MS分析，測定結果見表4。結果表明：視黃醇、視黃醇醋酸酯、維生素D2、維生素D3、維生素E的相對標準偏差分別為：2.77%、1.09%、4.77%、2.13%、2.60%。

表4 脂溶性維生素精密度測試結果Table 4 Precision of fat soluble vitamins (n=6)

2.4 與皂化后液液萃取-液相色譜法的比較

2.4.1 檢測對象比較

兩種方法在檢測對象上存在差異：皂化-液液萃取法在皂化處理過程中將維生素A、維生素E的酯水解為單體形式，統(tǒng)一了脂溶性維生素的檢測形式，因此無需配備各種酯化標準樣品。GPC為一種物理分離，在凈化過程中不改變維生素的化學形式，在檢測時需要了解維生素的添加形式，以選擇合適的標準樣品進行定性定量比較。

2.4.2 檢測方法學指標比較

對凝膠滲透色譜-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（方法一）與皂化-液液萃取液相色譜法（方法二）測定油脂性食品中脂溶性維生素含量方法進行比較，方法學指標比較結果見表 5。結果表明：方法一與方法二在一定濃度范圍內(nèi)都有較好的線性關系，但方法一的檢出限、回收率和精密度明顯優(yōu)于方法二。

表5 方法學指標比較結果Table 5 Comparison of methodology index

2.4.3 檢測效率比較

采用方法一前處理環(huán)節(jié)需要30 min，質(zhì)譜分析時間為15 min；方法二前處理環(huán)節(jié)需要皂化45 min、冷卻10 min、液液萃取及去除水分環(huán)節(jié)約需45 min、濃縮定容20 min、液相色譜分析時間為70 min。脂溶性維生素標準樣品液相色譜圖見圖3。

從單個樣品總分析時間比較方法一和方法二單個樣品凈分析時間分別為：45 min和170 min；從人力消耗上比較，方法一前處理環(huán)節(jié)可實現(xiàn)完全自動化、方法二除皂化過程外均需要人工操作。

圖3 為脂溶性維生素標準樣品液相色譜圖Fig.3 Liquid chromatogram of fat soluble vitamins standard sample

3 結論

以PT785 Bio-BeadsS-X3（填料質(zhì)量50 g）作為GPC分離色譜柱，環(huán)己烷-乙酸乙酯（5：5，V/V）溶液作為GPC流動相，流速為5 mL/min分離凈化食用植物油、動物脂肪、油脂性保健食品中脂溶性維生素。以0.1%甲酸5 mmol/L乙酸銨水溶液和甲醇作為質(zhì)譜流動相，結合ESI源，在正離子掃描模式條件下，采用LC-MS/MS同時測定維生素A、D、E含量結果滿意，該法與皂化液液萃取-液相色譜法測定油脂性食品中維生素 A、D、E含量方法相比具有準確性高、靈敏度高、自動化程度高和分析時間短等多重優(yōu)勢。