陳山喬，陳惠云，孫志棟，史婷婷，楊萌，張洪芹

（寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江寧波 315040）

水果在我國(guó)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)中占有重要地位，預(yù)計(jì)在2017年的水果總產(chǎn)量能夠達(dá)到279.4萬(wàn)噸[1]。而與之相悖的是，我國(guó)在農(nóng)產(chǎn)品，特別是容易變質(zhì)的水果產(chǎn)品，在貯藏流通環(huán)節(jié)中易造成產(chǎn)品的嚴(yán)重?fù)p耗。水果在采收后的相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)，依然保有活力并且進(jìn)行著生理活動(dòng)，但是由于其營(yíng)養(yǎng)和水分的供應(yīng)基本上被切斷，所以水果有著獨(dú)特的采后貯藏生理變化特性。有機(jī)酸和糖類物質(zhì)與水果在采后貯藏過(guò)程中的品質(zhì)下降有著密切的關(guān)系，這不僅是因?yàn)檫@些化合物是水果中主要的呈味物質(zhì)[2]，還在于水果的采后生理活動(dòng)都有這兩類物質(zhì)的參與[3]。特別是隨著化學(xué)計(jì)量學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展，結(jié)合通路數(shù)據(jù)庫(kù)，化合物定量分析能夠?qū)λ谫A藏中的生理變化特征有更深入的闡述。所以有機(jī)酸和糖類的測(cè)定對(duì)于研究水果貯藏保鮮至關(guān)重要。

定性和定量分析是對(duì)水果中有機(jī)酸和糖類研究的最初也是最重要的步驟之一。研究者們從很早開始就對(duì)食品基質(zhì)中有機(jī)酸和糖類的分析表現(xiàn)出了興趣，其中分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（AOAC）早在 1932年[4]和 1936年[5]分別刊發(fā)了食品中有機(jī)酸和單糖的官方測(cè)試方法。由于常規(guī)的化學(xué)分析方法干擾嚴(yán)重，并且無(wú)法同時(shí)測(cè)定多個(gè)化合物等缺陷[6]，所以基于色譜法的有機(jī)酸和小分子糖類分析方法受到了越來(lái)越多的關(guān)注。薄層色譜[7]和氣相色譜[8]等方法相繼被運(yùn)用其中，但是由于定量能力不足，以及衍生化過(guò)程中分析物產(chǎn)生的變構(gòu)、分解導(dǎo)致誤差加劇[9]等缺陷，使得高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）的應(yīng)用更顯優(yōu)勢(shì)。而隨著質(zhì)譜離子源技術(shù)的發(fā)展，液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)的普遍應(yīng)用，更是補(bǔ)足了HPLC的不足以及進(jìn)一步發(fā)揮了其長(zhǎng)處?；诖?，本文對(duì)廣義HPLC[10]測(cè)定有機(jī)酸、小分子糖類在水果保鮮研究中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述和展望。

1 水果中測(cè)定有機(jī)酸的HPLC和LC-MS方法

1.1 有機(jī)酸測(cè)定中的前處理

由于大多數(shù)水果的含水量高，除了少數(shù)種類外，普遍油脂含量較低，如表1所示，水果中使用HPLC法測(cè)定有機(jī)酸的流程中，前處理的方法相對(duì)簡(jiǎn)便。但是考慮色譜的分離效果，以及儀器的維護(hù)和耗材壽命，前處理相當(dāng)重要。水或者水和有機(jī)溶劑混合溶液萃取是最常用的提取方法。例如《GB 5009.157-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中有機(jī)酸的測(cè)定》[11]和《AOAC Official Method 986.13 Quinic, Malic, and Citric Acids in Cranberry Juice Cocktail and Apple Juice》[12]選用了水提作為通用的有機(jī)酸提取方法，而D'Urso等[13]使用了4倍體積甲醇對(duì)野草莓（Fragaria vesca）進(jìn)行了24 h的提取。Souza等[14]運(yùn)用10倍體積甲醇對(duì)番櫻桃進(jìn)行了24 h的提取。為了增加萃取效率，通常會(huì)使用超聲波對(duì)水果如覆盆子[15]和橄欖[16]進(jìn)行輔助提取。由于直接水提取的方法會(huì)將有機(jī)酸以外的其他親水性分子如蛋白質(zhì)和多糖，帶入提取溶液中，所以為了提高分析方法的專屬性以及色譜柱維護(hù)考慮，水提方法通常會(huì)配合固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）來(lái)去除雜質(zhì)分子[12,17]，如Espa?a等[17]對(duì)桃汁進(jìn)行了SPE凈化后，能夠直接進(jìn)樣分析。由于有機(jī)酸是含有羧基的酸性化合物，所以在有機(jī)溶劑萃取的過(guò)程中會(huì)將萃取溶劑酸化，使有機(jī)酸以小極性形態(tài)進(jìn)入有機(jī)相以提高萃取效率[13,18,19]，如Urso等[13]使用了甲酸對(duì)提取溶劑進(jìn)行了酸化，而Parets等[19]選擇了鹽酸對(duì)由水和丙酮組成的提取溶劑進(jìn)行酸化，對(duì)蔓越橘中的有機(jī)酸進(jìn)行了提取。綜上所述，由表1中歸納所得，面向于最大范圍的水果或食品基質(zhì)的權(quán)威檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，更傾向于純水提取以達(dá)到最大的普適性。相反的，針對(duì)于某一特定水果的研究性論文所報(bào)道的提取方法，通常會(huì)根據(jù)具體的研究對(duì)象，使用不同的溶劑體系，以及超聲，酸化等輔助手段。

1.2 有機(jī)酸的HPLC分離

目前已經(jīng)有多種適用于甚至專門針對(duì)于水果中有機(jī)酸分離的HPLC柱產(chǎn)品，按照其填料類型和分離原理，可以分為反相（reverse phase，RP），親水作用力（hydrophilic interaction chromatography，Hilic）（其中包括氨基鍵合填料）以及離子色譜（ion chromatography，IC）填料。

有機(jī)酸在一定酸度環(huán)境下能夠在離子形態(tài)和分子形態(tài)間相互轉(zhuǎn)換，所以在色譜分配上有著較寬的極性適用度，因此RP-HPLC特別是以C18為鍵合基團(tuán)的色譜柱填料有著很廣泛的應(yīng)用。值得一提的是最新的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB 5009.157-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中有機(jī)酸的測(cè)定》[11]和 AOAC發(fā)布的官方檢測(cè)方法《AOAC Official Method 986.13 Quinic, Malic, and Citric Acids in Cranberry Juice Cocktail and Apple Juice》[12]都選擇了使用C18鍵合的RP-HPLC進(jìn)行了有機(jī)酸的分離。除此以外，也有為有機(jī)酸分離所特別優(yōu)化的反相色譜柱被應(yīng)用于水果的研究[13]，如劉曉雪等[20]使用了T3色譜柱對(duì)橘子和樹莓中的有機(jī)酸進(jìn)行了分離。這類經(jīng)過(guò)了末端封閉或者擔(dān)體加固的色譜柱，能夠耐受高酸度和純水流動(dòng)相，為有機(jī)酸在固定相和流動(dòng)相間提供了足夠大的分配系數(shù)差異從而進(jìn)一步提高分離效果。其中有研究[20]對(duì)多種不同填料的色譜柱在有機(jī)酸分析中的效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)和比較，發(fā)現(xiàn)特別優(yōu)化的反相柱擁有最好的分離效果。而傳統(tǒng)的 C8填料，在蘋果和檸檬的有機(jī)酸分析中，也有見諸報(bào)道[21]。

除了RP-HPLC外，屬于廣義HPLC[10]的IC也在水果中有機(jī)酸的分離中有著一定的應(yīng)用。其中現(xiàn)行有效的兩部農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)《NY/T 2277-2012水果蔬菜中有機(jī)酸和陰離子的測(cè)定 離子色譜法》[22]和《NY/T 2796-2015水果中有機(jī)酸的測(cè)定 離子色譜法》[23]分別采用了高效離子交換色譜（high performance anion/cation exchange chromatography，HPAEC/CEC）法和高效離子排斥色譜法（high performance ion exclusion chromatography，HPIEC）作為有機(jī)酸的分離方法。而離子色譜在研究性論文中的運(yùn)用則相對(duì)較少，例如Schouten等[3]使用HPIEC法對(duì)番茄汁中蘋果酸和檸檬酸進(jìn)行了分離。除了離子色譜在耗材成本和普適性上均劣于反相色譜外，水果中除了有機(jī)酸外，還富含如氨基酸，糖醛酸，礦物質(zhì)鹽等其他離子容易對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生干擾也是其在水果有機(jī)酸分析中受到限制的可能原因。然而得益于離子色譜在分離離子化合物時(shí)良好的分辨率，在分析標(biāo)準(zhǔn)中，離子色譜依然不失為一種實(shí)用的方法。

由于有機(jī)酸作為親水性化合物，所以Hilic色譜也被成功應(yīng)用于分離中[20,21,24]。但鑒于Hilic色譜的分離效率以及柱流失的問(wèn)題[25]，這在水果有機(jī)酸的分析中運(yùn)用并不廣泛。

如表1所示，RP-HPLC法和IC法是最主流的有機(jī)酸分離方法，兩者皆有被正式公布的官方檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)所選用，其中引用RP分離模式的文獻(xiàn)占據(jù)了最大的數(shù)量，雖然RP色譜在有機(jī)酸的分離中存在著專屬性不高等缺點(diǎn)，但是通過(guò)下述的質(zhì)譜檢測(cè)器的補(bǔ)足，此類方法在研究領(lǐng)域中擁有最廣泛的應(yīng)用。在使用非質(zhì)譜檢測(cè)器的分析方法中，HPIEC法通常有著更高的靈敏度和分辨率[26]。Hilic色譜由于上述的柱流失原因造成的重現(xiàn)性下降[25]，使用并不廣泛，但如果借助LC-MS的定性能力，在一定程度上能夠克服這個(gè)缺陷。

1.3 有機(jī)酸的HPLC分析法中的檢測(cè)器

由于大多數(shù)有機(jī)酸有紫外吸收，所以廣義的紫外檢測(cè)器包括紫外-可見檢測(cè)器（UV-VIS），和光電二極管陣列檢測(cè)器（diode array detector，DAD）在反相色譜分離時(shí)應(yīng)用廣泛，其中包括上述的國(guó)家和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)[11,12]。為了能夠盡量多的覆蓋到各種有機(jī)酸的紫外吸收，檢測(cè)波長(zhǎng)通常被設(shè)置為末端吸收的210 nm附近[15,18,27]，而對(duì)于一些在特定波長(zhǎng)有強(qiáng)吸收的有機(jī)酸，也有研究會(huì)針對(duì)性地設(shè)置檢測(cè)波長(zhǎng)，如Shwartz等[24]設(shè)置254 nm對(duì)石榴中的抗壞血酸進(jìn)行了檢測(cè)。此外在 IC和 Hilic分離之后紫外檢測(cè)器也常常被使用到[28]。經(jīng)過(guò)表1中檢測(cè)方法的匯總比較，可見雖然紫外檢測(cè)器的應(yīng)用廣泛，然而其精密度和檢測(cè)限（LOD）以及（LOQ）相比于其他檢測(cè)器，特別是質(zhì)譜檢測(cè)器，存在很大劣勢(shì)。

在基于IC的檢測(cè)中，除了UV外，電化學(xué)檢測(cè)器（electrochemical detect，ECD）[3]及其子集電導(dǎo)檢測(cè)器（conductivity detector，CD）[22]也有運(yùn)用。而且得益于CD的高靈敏度以及和IC的高契合度，農(nóng)業(yè)部的推薦標(biāo)準(zhǔn)，《NY/T 2277-2012水果蔬菜中有機(jī)酸和陰離子的測(cè)定 離子色譜法》[22]和《NY/T 2796-2015水果中有機(jī)酸的測(cè)定 離子色譜法》[23]，選用了CD作為檢測(cè)方法。如表1所示，ECD檢測(cè)器在靈敏度上達(dá)到了質(zhì)譜的水平，然而考慮適用范圍的原因，ECD類檢測(cè)器的使用更加側(cè)重在有機(jī)酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中。

隨著離子源技術(shù)的發(fā)展，各種類型的質(zhì)譜檢測(cè)器（mass spectrometry detector，MSD）逐漸進(jìn)入研究者的視野中。LC-MS將質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）直接作為HPLC的檢測(cè)器，結(jié)合了HPLC的高分離能力和MS的高靈敏度、高分辨率以及高定性能力，具有遠(yuǎn)勝于常規(guī)HPLC的分析能力。由于前述的紫外檢測(cè)器通常設(shè)置的波長(zhǎng)靠近末端吸收，對(duì)檢測(cè)帶來(lái)了巨大的干擾，所以RP-HPLC分析水果有機(jī)酸時(shí)，MSD成為極其優(yōu)秀的檢測(cè)器。關(guān)于RP-HPLC-MS的研究，有著大量的報(bào)道。

作為最常規(guī)的有機(jī)質(zhì)譜離子源，水果有機(jī)酸的分析中，電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）占據(jù)了主流地位，但是其他類型的離子源，例如大氣壓光化學(xué)離子源（atmospheric pressure photoionization source，APPI）[19]也有文獻(xiàn)報(bào)道。由于有機(jī)酸擁有解離出H+成為酸根負(fù)離子的能力，本綜述所引用的所有文獻(xiàn)報(bào)道中，對(duì)有機(jī)酸的檢測(cè)，均選擇負(fù)離子模式。和離子源的選擇不同，質(zhì)量分析器在選擇上呈現(xiàn)了更大的多樣化，如三重四級(jí)桿（triple quadrupole detector，TQD）[13,20,21]，離子阱（ion trap，IT）[19,29]以及高精度的軌道阱質(zhì)譜（orbitrap）[13]。得益于MSD能夠有效檢測(cè)色譜端的共流出被分析物，所以 LC-MS法檢測(cè)中，常規(guī)的 C18也能有很好的分析效果[13,14,17,19,20,29]。Hilic柱在搭配MSD檢測(cè)時(shí)，由于MSD的定性能力，對(duì)柱流失造成的保留時(shí)間偏移有著更高的糾正能力[21]。雖然 LC-MS有著諸多優(yōu)點(diǎn)，但是其普及還面臨著很多問(wèn)題，首當(dāng)其沖的便是其高昂的設(shè)備價(jià)格和運(yùn)維成本，以及對(duì)操作人員有著更高的培訓(xùn)要求，這可能就是有機(jī)酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有選用LC-MS方法的原因。

綜上所述，UV-VIS和DAD這兩種基于化合物的紫外吸收特性的檢測(cè)器有最低的成本以及無(wú)損檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，除了有單獨(dú)的廣泛應(yīng)用外，還常常和MSD聯(lián)用以對(duì)LC-MS的檢測(cè)形成補(bǔ)充。MSD由于離子抑制的原因，通常搭配RP-HPLC或者Hilic-HPLC使用。特別是Hilic，如前述，MSD的定性能力能夠?qū)ΡＡ魰r(shí)間偏移進(jìn)行糾正。同時(shí)，MSD的檢出限和精密度都比常規(guī)的檢測(cè)器更高。然而運(yùn)維成本一直是其固有缺陷。而CD和ECD通常與IC結(jié)合使用，其中原因除了IC的流動(dòng)相對(duì)此類檢測(cè)器干擾最小外，成熟的商業(yè)解決方案的存在也是原因之一。

表1 水果中有機(jī)酸高效液相色譜法檢測(cè)文獻(xiàn)匯總Table 1 Summary of collected references reporting organic acid evaluation by HPLC

注：*檢測(cè)限；**定量限；#以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示。

表2 水果中小分子糖高效液相色譜法檢測(cè)文獻(xiàn)匯總Table 2 Summary of collected references reporting small-molecular saccharides eval

紅棗葡萄糖，果糖，甘露糖，半乳糖，鼠李糖，木糖，阿拉伯糖，半乳糖醛酸，蔗糖，棉子糖，水蘇糖，巖藻糖，蔗果三糖，蔗果四糖乙醇水提取，超聲波配體交 換水質(zhì)譜ES I+，IT精密度=0.52%～8.33%學(xué)位論文[53]楊桃葡萄糖，果糖，蔗糖乙醇水提取HP CE C水光學(xué)RI檢出限=0.05 m g/L學(xué)位論文[18]葡萄葡萄糖，果糖水提取Hilic乙腈+水，等度光學(xué)RI精密度=0.52%～1.22%，回收率=99.81%～100.4%研究論文[39]火龍果甘露糖，鼠李糖，葡萄糖，乳糖，半乳糖，阿拉伯糖水提取，S PE，T FA水解，P MP衍生RP乙腈+誰(shuí)，等度光譜DA D，245 nm未報(bào)道研究論文[36]枇杷果糖，葡萄糖，麥芽糖乙醇水提取，超聲波Hilic乙腈+水，等度光學(xué)RI r2=0.99950～0.99960學(xué)位論文[28]羅漢果葡萄糖，甘露糖，果糖，蔗糖，棉籽糖乙醇水提取，S PE，PM P衍生RP乙腈+水，梯度光譜，光學(xué)UV，245nm，RI批內(nèi)精密度＜1.0%，批間精密度＜3%，重現(xiàn)性=1.5%～3.0%研究論文[46]雪蓮果葡萄糖，果糖，蔗糖，蔗果三糖，蔗果四糖乙腈水提取Hilic乙腈+水，等度光學(xué)RI r2=0.9965～0.9995研究論文[47]食品果糖，葡萄糖，蔗糖，麥芽糖，乳糖水提取乙鉀酸凈鋅化-亞鐵氰，化Hilic乙腈+水，等度光學(xué)RI，E LS D精密度＜10%標(biāo)準(zhǔn)[40]

2 水果中測(cè)定小分子糖的HPLC和LC-MS方法

2.1 小分子糖測(cè)定中的前處理方法

水果中的小分子糖有兩種存在形式，分別為組織中的游離糖，和多糖的組成部分。對(duì)于多糖中的單糖和寡糖單元，分析的前處理步驟之中需要將多糖水解，以得到游離狀態(tài)的小分子糖。如表2所示，酸水解法是最常用的方法，其中三氟乙酸（TFA）[32～37]和鹽酸（HCl）[32,38]都被用到。其中有研究[32]比較了TFA和HCl水解條件下單糖的回收率，發(fā)現(xiàn)在同樣的水解參數(shù)下，TFA的得率更高，但是單糖的分解依然存在。這一研究表明，在多糖水解的步驟中，條件的優(yōu)化是至關(guān)重要的。另外，酶也被用于香蕉中多糖的水解[38]。

對(duì)于游離的小分子糖，水[39～41]和有機(jī)溶劑[13,18,24,42～47]提取是常用的前處理提取方法。與有機(jī)酸的前處理一樣，超聲波也能應(yīng)用于輔助提取[40,41,44]。由于后述的小分子糖類的色譜分離經(jīng)常會(huì)涉及到耐受性較低的色譜體系，所以對(duì)前處理過(guò)程中的凈化除雜需要更高的要求。除了利用乙腈和甲醇等有機(jī)溶劑本身來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀以外，乙酸鉛[43]，鐵氰化鉀[40]和正丁醇[45]都有報(bào)道被用于蛋白質(zhì)的脫除，SPE也被使用來(lái)進(jìn)行小分子糖類試樣的凈化[18,46]。在檢測(cè)桃核中游離小分子糖類的研究[45]中庚烷和乙酸乙酯分別被用來(lái)進(jìn)行脂質(zhì)和酚類的脫除。

2.2 小分子糖類的HPLC分離

對(duì)水果中小分子糖類的廣義HPLC分離，按照原理，和有機(jī)酸類似，可以分為RP，Hilic以及IC。

小分子糖類作為多羥基化合物，擁有比較極端的親水性，所以未經(jīng)過(guò)衍生的小分子糖尚無(wú) RP-HPLC直接的分離的報(bào)道。但是經(jīng)過(guò)1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生的小分子糖，由于極性的改變?cè)诜聪嗵盍仙夏軌蜻M(jìn)行保留，所以經(jīng)過(guò) PMP衍生步驟的小分子糖 HPLC分析，大多選用成熟穩(wěn)定的 C18 RP-HPLC[33,36,37,46]。

由于糖類的高親水性，Hilic是一種非常適合的色譜分離方法。除了常規(guī)的氨基柱和專用Hilic柱外，很多廠家都有推出為分離糖類針對(duì)性設(shè)計(jì)的 Hilic原理色譜柱。無(wú)論是對(duì)于多糖的水解產(chǎn)物[34,35]還是組織中的游離糖[39,40,42,43,47]，Hilic色譜都做到了成功的分離。其中國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB 5009.8-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測(cè)定》[40]即選用了氨基柱進(jìn)行單糖的分離。如表2所示，Hilic色譜在研究中廣泛用于小分子糖的分離，然而與其他分離模式比較，匯總的文獻(xiàn)中Hilic色譜能夠同時(shí)檢測(cè)的糖類較少，這可能是由于分離專屬性不足所致。

IC，特別是高效離子交換色譜在水果小分子單糖的分析中也有著廣泛的應(yīng)用[32,34,41,42,45]?；谔穷惙肿釉诟邏A性條件下能夠轉(zhuǎn)化為陰離子形態(tài)[48,49]，使用IC進(jìn)行小分子糖分離時(shí)，必須選用強(qiáng)堿性流動(dòng)相。其中AOAC官方分析方法《AOAC Official Method 2000.17 Determination of Trace Glucose and Fructose in Raw Cane Sugar》[50]將HPAEC/CEC定為果糖和葡萄糖的分離方法。

2.3 小分子糖的HPLC分析法中的檢測(cè)器

由于大多數(shù)糖類分子在遠(yuǎn)離末端的波長(zhǎng)下沒(méi)有紫外吸收，所以對(duì)于未經(jīng)衍生的小分子糖無(wú)法使用UV-VIS和DAD進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于經(jīng)過(guò)PMP衍生后的糖分子，其在245 nm下有特征性的紫外吸收，所以對(duì)于PMP柱前衍生結(jié)合RP-HPLC分離的水果小分子糖類檢測(cè)方法，均在245 nm下使用紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)[33,36,37,46]。PMP衍生既能使糖分子在反相固定相上得到保留，又能夠使待分析物呈現(xiàn)紫外吸收，是一種低投入的高效分析方法。但是衍生化的過(guò)程往往會(huì)帶來(lái)誤差和額外的成本，而且只有還原性的糖才能被PMP衍生。

對(duì)于未衍生的水果小分子糖類，不依賴紫外吸收的檢測(cè)器都有很好的表現(xiàn)。其中示差折光檢測(cè)器（refractive index detector，RI）作為常見通用檢測(cè)器，在小分子糖類的檢測(cè)中應(yīng)用廣泛。而歸納比較收集到的文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，示差檢測(cè)器在水果小分子糖類的分析中，都是配合Hilic色譜使用[2,35,39,42,47]。這可能是和Hilic分離過(guò)程中流動(dòng)相組成較為簡(jiǎn)單，并且沒(méi)有極端的酸堿度有關(guān)。由于Hilic-HPLC和高普及度的RP-HPLC差異僅僅在色譜柱和流動(dòng)相組成上，不需要額外購(gòu)置HPLC配件，所以Hilic-RI是很好的低成本水果小分子糖類分析手段。但是由于RI檢測(cè)器的靈敏度低，并且無(wú)法使用梯度洗脫條件，使得研究者們對(duì)其他更高效的檢測(cè)手段有著巨大的需求。

蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（evaporative light scattering detector，ELSD）是新一代的通用檢測(cè)器。得益于其通過(guò)將待測(cè)分子以氣態(tài)或氣溶膠顆粒形態(tài)的散射光作為檢測(cè)原理，ELSD對(duì)沒(méi)有發(fā)色基團(tuán)的小分子糖類有著很好的適用性。其中前述的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[40]將ELSD作為檢測(cè)手段。和RI類似，使用ELSD的檢測(cè)通常也會(huì)搭配Hilic分離進(jìn)行[34,40,44]。這是因?yàn)镋LSD的原理要求待測(cè)物質(zhì)的揮發(fā)性必須低于流動(dòng)相，并且流動(dòng)相中需要盡量少的添加非揮發(fā)性物質(zhì)所致[51]。相較于RI，ELSD在靈敏度和基線穩(wěn)定性上有著更高的性能，并且能夠使用梯度洗脫模式，但是ELSD除了較高的購(gòu)置成本外，在運(yùn)行時(shí)需要額外的載氣供應(yīng)使得其并沒(méi)有RI使用的廣泛。

在結(jié)合IC分離小分子糖的研究中，電化學(xué)檢測(cè)器（electrochemical detector，ECD）特別是脈沖安倍檢測(cè)器（pulsed amperometric detector，PAD）得到了廣泛的應(yīng)用。例如前述的AOAC官方標(biāo)準(zhǔn)[50]就將PAD設(shè)為檢測(cè)方法。整理文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，IC和PAD通常都是配合使用[32,34,41,42,45,50]，研究者們傾向于這種選擇可能是由于在碳水化物分析中，PAD在強(qiáng)堿性的IC流動(dòng)相環(huán)境中有著更好的信號(hào)響應(yīng)，并且通過(guò)脈沖多電位能夠抑制被分析化合物在電極上的沉積所帶來(lái)的基線漂移[52]。如表2所歸納，ECD檢測(cè)器的靈敏度和精密度媲美質(zhì)譜檢測(cè)器，而儀器的購(gòu)置和運(yùn)維成本則接近常規(guī)的HPLC，這可能是IC和ECD在小分子糖分析中廣受青睞的原因。

同樣，MSD在小分子糖的檢測(cè)中也得到了應(yīng)用[34,43,53]。如表2所示，其中對(duì)于ESI離子源的離子化極性，呈現(xiàn)了多樣化，正離子模式[53]和負(fù)離子模式[43]都有使用。在關(guān)于椰棗中單糖和寡糖的研究中[43]正離子模式和負(fù)離子模式被進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)負(fù)離子模式有著更多的信號(hào)響應(yīng)。和IR以及ELSD一樣，MSD在水果小分子糖的檢測(cè)中與 Hilic色譜的配合使用最為常見。由于糖類通常存在多種同分異構(gòu)體，所以MSD在應(yīng)用于糖類檢測(cè)時(shí)，通常會(huì)選用有多級(jí)質(zhì)譜能力的TQD[43]或者IT[34,53]作為質(zhì)量分析器。

綜上所述，小分子糖因其分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，沒(méi)有大的共軛體系，無(wú)法表現(xiàn)出遠(yuǎn)離末端吸收的光譜特特征，所以UV-VIS檢測(cè)器無(wú)法適用于其色譜分析。而IR檢測(cè)器由于檢測(cè)靈敏度有限，以及無(wú)法適用色譜的梯度洗脫模式，其應(yīng)用也受到了限制。所以在未衍生的情況下小分子糖類液相分析中檢測(cè)器的選擇相對(duì)有機(jī)酸范圍狹窄。另外，由于單糖在組成寡糖時(shí)有多種接合位點(diǎn)和構(gòu)象，導(dǎo)致小分子寡糖就有相對(duì)復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，所以在研究中，高精度和多級(jí)的質(zhì)譜檢測(cè)器被廣泛應(yīng)用以提高定性能力。

3 結(jié)論與展望

隨著色譜分析技術(shù)的發(fā)展，HPLC方法對(duì)水果基質(zhì)中少數(shù)特定種類的有機(jī)酸和單糖的測(cè)定已經(jīng)趨于成熟，且有多種國(guó)內(nèi)外的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)可供研究者和工業(yè)界參考。在探索性研究中，從目的和分析性能考慮，RP-HPLC-MS和Hilic-HPLC-MS是最佳的檢測(cè)手段，不僅是因?yàn)槠鋬?yōu)秀的檢測(cè)性能，而且MSD能夠提供豐富的化合物結(jié)構(gòu)信息，甚至能夠一定程度脫離對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的依賴。而出于成本考慮，RP-HPLC結(jié)合UV檢測(cè)器并且在部分檢測(cè)過(guò)程中進(jìn)行柱前衍生化，可以在不需要購(gòu)置任何額外組件的情況下在常規(guī)HPLC上完成檢測(cè)。在工業(yè)界的應(yīng)用中，被檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)廣泛采用，并且有成熟的商業(yè)化整合方案的HPEIC-PAD檢測(cè)有著最高的綜合性價(jià)比。

對(duì)于這兩類化合物，未來(lái)的發(fā)展方向是提升總體的檢測(cè)效率，比如開發(fā)能夠同時(shí)檢測(cè)多種目標(biāo)化合物的分析方法。為此，在水果的研究中越來(lái)越多的用到，不需要依賴分析物特定的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征，并且可以對(duì)色譜分離中共流出問(wèn)題和保留時(shí)間偏移問(wèn)題形成互補(bǔ)性補(bǔ)償?shù)?LC-MS方法。另外各種針對(duì)有機(jī)酸和糖類分析優(yōu)化的新型色譜柱和填料也被設(shè)計(jì)出來(lái)。此外，對(duì)于糖類來(lái)說(shuō)，由于其普遍存在同分異構(gòu)體并且能夠形成數(shù)量眾多的寡聚體，對(duì)于分析方法的定性能力有著更高的要求，應(yīng)用多級(jí)質(zhì)譜和高精度質(zhì)譜檢測(cè)器對(duì)于常規(guī)檢測(cè)器難以分析結(jié)構(gòu)的小分子寡糖的定性定量也至關(guān)重要。