唐志康 陳文秋 余敏靈

摘要：以疊鞘石斛（Dendrobium aurantiacum）為研究對象，樣品采用乙腈提取，經Cleanert TPH專用凈化柱凈化。用GC-MS/MS測定樣品，根據(jù)色譜相對保留時間和質荷比信息對樣品進行定性分析，以樂果二級離子掃描峰（125.0/79.0）面積為參照峰，建立以樂果為對照品，測定疊鞘石斛中樂果等三種農藥殘留量的GC-MS/MS方法。結果表明，樂果、敵敵畏、毒死蜱進樣量在0.1～1.0 ng與它們的色譜峰面積有較好的線性關系，最低檢出限（以進樣量計）分別為1.399×10-2、2.279×10-4、1.757×10-4 ng；平均回收率分別為95.4%、95.0%、94.7%。該一測多評方法簡單快速，定量準確，適用于疊鞘石斛中樂果、敵敵畏、毒死蜱農藥殘留的同時測定。

關鍵詞：GC-MS/MS；疊鞘石斛（Dendrobium aurantiacum）；樂果；敵敵畏；毒死蜱

中圖分類號：O657.7+2 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）17-0088-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.17.023 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： To establish a quantitative method for the simultaneous measurement of the residual level of three pesticides in Dendrobium aurantiacum by GC-MS/MS. The samples were extracted by acetonitrile and purify by Cleanert TPH column. The samples were then tested by GC-MS/MS. Information on relative retention time and mass charge ratio was used for qualitative analysis. The peak area obtained by secondary ion MS of dimethoate（125.0/79.0） was used as the reference peak to establish a method using dimethoate as the reference substance to determinate there sidual quantity of three pesticides in Dendrobium aurantiacum by GC-MS/MS. When the injection quantity of the sample containing dimethoatea， dichlorvos and chlorpyrifosis in the range of 0.1～1.0 ng， there is a good linear relationship between the injection quantity and peak area. Limit of quantification（LOQ） of dimethoate， dichlorvos and chlorpyrifos are 1.399×10-2、2.279×10-4、1.757×10-4 ng； The average recovery rates of dimethoate， dichlorvos and chlorpyrifos are 95.4%， 95.0% and 94.7%. the method is simple， accurate， rapid and is appropriate for the quantification of residual quantity of dimethoate，dichlorvos and chlorpyrifos in Dendrobium aurantiacum.

Key words： GC-MS/MS； Dendrobium aurantiacum； dimethoate； dichlorvos； chlorpyrifos

中藥材種植及中藥飲片加工儲存過程中農藥的不當使用，均會影響中藥材中藥飲片質量，嚴重危害人體健康[1]?！吨袊幍洹?015年版四部收載了多種農藥殘留的氣相色譜檢查方法[2]。近年來，對農藥殘留量研究報道的文獻大多以氣相色譜、液相色譜或以其與質譜的聯(lián)用為主[3-8]。應用GC-MS/MS，根據(jù)色譜保留時間和質荷比信息對樣品進行定性分析，以樂果二級離子掃描色譜峰（125.0/79.0）面積為參照，建立GC-MS/MS測定疊鞘石斛（Dendrobium aurantiacum）中樂果等3種農藥殘留一測多評方法[9]，取得了滿意的結果，現(xiàn)將試驗結果報道如下，以期為GC-MS/MS測定中藥材農藥殘留量提供一測多評[10-13]研究思路。

1 材料與儀器

1.1 材料

樂果、敵敵畏、毒死蜱標準品溶液（規(guī)格：100 μg/mL，樂果、敵敵畏、毒死蜱批號分別為GSB05-2286-2016、GSB05-2298-2016、GSB05-1849-2016，農業(yè)部環(huán)境監(jiān)測保護研究所）。乙腈、丙酮為色譜純，氯化鈉、無水硫酸鈉為優(yōu)級純。疊鞘石斛樣品分別采于四川省夾江縣歇馬鄉(xiāng)、麻柳鄉(xiāng)、華頭鎮(zhèn)，按四川省中藥材標準（2010年版）鑒定[9]，并按該標準炮制規(guī)范制成3個批號樣品（歇馬鄉(xiāng)樣品為20161209-1，麻柳鄉(xiāng)樣品為20161209-2，華頭鎮(zhèn)樣品為20161209-3）。

1.2 儀器

GCMS-TQ8030氣質聯(lián)用儀（島津中國科技有限公司）；Rxi-5SilMS，30 m×0.25 mm×0.25 μm毛細管柱，工作站為LabSolutions GCMS Solutions版本4.20（島津中國科技有限公司）；Cleanert TPH凈化柱（天津博納艾潔爾公司）。

1.3 方法

以樂果為對照品測定樣品中樂果、敵敵畏、毒死蜱的原理是利用樣品色譜圖中樂果色譜峰和敵敵畏色譜峰、毒死蜱色譜峰相對保留時間進行定位[2]；二級離子碎片圖譜中樂果在47.0、62.0、79.0有碎片離子峰（豐度比為155∶13∶100，以79為參比），敵敵畏二級離子碎片圖譜中在63.0、93.0、109.0有碎片離子峰（豐度比為24∶100∶25，以93為參比），毒死蜱二級離子碎片圖譜中在19.9、257.9、285.9有碎片離子峰（豐度比為24∶100∶49，以258為參比）；通過定位和二級離子碎片圖譜碎片離子峰以及其豐度比對樂果、敵敵畏、毒死蜱色譜峰進行定性分析。在定量分析時，精密量取樂果、敵敵畏、毒死蜱標準品溶液各適量，配制成不同濃度的混合溶液，按設定條件進樣，記錄色譜圖，繪制樂果、敵敵畏、毒死蜱進樣量對其峰面積的回歸曲線，以樂果回歸曲線斜率與敵敵畏、毒死蜱回歸曲線斜率的比計算校正因子（fs/k=Ks/Kk），通過樂果回歸曲線計算樂果含量，通過校正因子及樂果回歸曲線計算敵敵畏、毒死蜱含量。

1.3.1 標準儲備溶液的制備 精密量取樂果、敵敵畏、毒死蜱標準溶液各1 mL于10 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻，作為標準儲備溶液（每1 mL含樂果、敵敵畏、毒死蜱各10 μg）。

1.3.2 樣品溶液和空白溶液的制備 取疊鞘石斛（20161209-1）約50 g，粉碎，過3號篩，精密稱取細粉1.062 1 g于50 mL離心管中，加入15 mL乙腈，15 000 r/min勻漿提取1 min，加入2 g氯化鈉，再勻漿提取1 min，4 200 r/min離心5 min，取上清液于150 mL雞心瓶中，再于離心管中加入15 mL乙腈，按上述方法重復勻漿提取一次，合并提取液，于40 ℃水浴旋轉蒸發(fā)至約1 mL。Cleanert TPH固相萃取柱上加入約2 cm高無水硫酸鈉，用10 mL正己烷-丙酮（6∶4）預洗后，將樣品濃縮液移入柱中，用25 mL正己烷-丙酮（6∶4）洗脫，收集洗脫液于40 ℃水浴旋轉濃縮至近干，用丙酮定容至1 mL，0.2 μm濾膜過濾即得；除稱取樣品粉末外，按上述操作制備空白溶液。

1.3.3 樣品加標溶液的制備 精密稱取“1.3.2”疊鞘石斛粉末1.021 3 g，按“1.3.2”樣品溶液的制備方法，從“置50 mL離心管中起到收集洗脫液于40 ℃水浴旋轉濃縮至近干”，轉移至1 mL量瓶中，加標準儲備溶液5 μL，用丙酮稀釋至刻度，搖勻，0.2 μm濾膜過濾即得。

1.3.4 氣相條件 采用Rxi-5SilMS，30 m×0.25 mm×0.25 μm毛細管柱，進樣口溫度250 ℃；線速度47.2 cm/s；程序升溫：50 ℃保持1 min，以25 ℃/min速率升至125 ℃，再以10 ℃/min速率升至300 ℃，保持15 min。進樣體積1 μL。載氣：高純氦氣（>99.999%）。

1.3.5 質譜條件 離子源溫度200 ℃；接口溫度250 ℃；溶劑延遲時間5 min；碰撞氣為氬氣（純度大于99.999%）；電離方式見表1。

1.4 方法學考察

1.4.1 線性關系考察 精密量取標準儲備溶液50、100、200、250、300、400、500 μL分置于7個5 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻。以樂果、敵敵畏、毒死蜱二級離子掃描峰面積分別與對應的樂果、敵敵畏、毒死蜱進樣量進行線性回歸。

1.4.2 精密度試驗 精密量取標準儲備溶液0.2～5.0 mL于量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻進行測定，重復進樣6次測定精密度。

1.4.3 重復性試驗 精密量取標準儲備溶液200 μL，分別置6個5 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻。分別進樣測定重復性。

1.4.4 樣品溶液穩(wěn)定性考察 取樣品加標溶液分別在0、2、4、8、12、14、16、20、24 h進樣，測定樣品穩(wěn)定性。

1.4.5 最低檢出限 取樣品加標溶液，按測定條件測得樂果、敵敵畏、毒死蜱的信噪比（S/N）分別為10.72、658.14、853.77，以S/N的3倍計算最低檢出限、10倍計算最低定量限。

1.4.6 回收率試驗 取“1.3.2”方法的粉末9份，每份約1 g，精密稱定，分置9個50 mL離心管中，分為3組，每組3份，第1組中每份加標準儲備溶液40 μL，第2組中每份加標準儲備溶液50 μL，第3組中每份加標準儲備溶液60 μL。取樣品溶液按測定條件分別進樣，記錄圖譜；另取樂果對照品溶液用丙酮稀釋至含樂果0.1、0.3、0.5、0.7、1.0 μg/mL的溶液，按測定條件分別進樣，記錄色譜圖，計算樂果二級離子掃描峰面積和進樣量間的回歸方程得：A=615 047m-100.3（n=5，r=0.999 6），按回歸方程A=615 047m-102.4計算供試品中樂果含量；按校正方程A敵敵畏=615 047mf敵敵畏/樂果-102.4計算敵敵畏含量，按校正方程A毒死蜱=615 047mf毒死蜱/樂果-102.4計算毒死蜱含量。

2 結果與分析

2.1 圖譜解析

精密量取標準儲備溶液250 μL于5 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。在“1.3.4”“1.3.5”條件下測定，取對照品溶液、樣品溶液、樣品加標溶液、空白溶液分別進樣，記錄色譜圖，在對照品溶液二級離子掃描色譜譜圖中有樂果二級離子掃描（125/79）、敵敵畏二級離子掃描（185/93）和毒死蜱二級離子掃（313.9/257.9）色譜峰，保留時間分別為10.663、5.690、13.191 min，在空白溶液色譜圖和樣品溶液色譜圖中沒有上述色譜峰，在樣品加標溶液色譜圖中有和對照品溶液色譜圖中保留時間一致的樂果、敵敵畏、和毒死蜱二級離子掃描色譜峰，如圖1；對照品溶液和樣品加標溶液的二級離子碎片圖譜中樂果在47、62、79處（豐度比為155∶13∶100，以79為參比），敵敵畏在63、93、109處（豐度比為24∶100∶25，以93為參比），毒死蜱在194、258、286處（豐度比為24∶100∶49，以258為參比），均有二級離子碎片峰，如圖2。

2.2 線性關系考察

以樂果二級離子掃描（125.0/79.0）峰面積A1與樂果進樣量m1（ng）進行線性回歸，得回歸方程：A1=615 311m1-173，r1=0.999 8（n=7），樂果進樣量在0.1～1.0 ng與樂果二級離子掃描峰（125.0/79.0）面積有較好的線性關系；以敵敵畏二級離子掃描峰（185.0/93.0）面積A2與敵敵畏進樣量m2（ng）進行線性回歸，得回歸方程：A2=2 016 535m2-203，r2=0.999 7（n=7），敵敵畏進樣量在0.1～1.0 ng與敵敵畏二級離子掃描峰（18.05/93.0）面積A2有較好的線性關系；以毒死蜱二級離子掃描峰（313.9/257.9）面積A3與毒死蜱進樣量m3進行線性回歸，得回歸方程：A3=1 278 304

m3-68，r3=0.999 3（n=7），毒死蜱進樣量在0.1～1.0 ng與毒死蜱二級離子掃描峰（313.9/257.9）面積有較好的線性關系。

2.3 f值和t值的計算與耐受性考察

2.3.1 f值和t值的計算 敵敵畏色譜峰峰面積和樂果色譜峰峰面積的校正因子f敵敵畏/樂果=3.277 3，相對保留時間t敵敵畏/樂果=0.533 6；毒死蜱色譜峰峰面積和樂果色譜峰峰面積的校正因子f毒死蜱/樂果=2.077 5，相對保留時間t毒死蜱/樂果=1.237 1。

2.3.2 f值的耐受性考察 實際應用中，色譜條件可能會有一些變化，因此對線速度、進樣量可能影響f值的因素進行考察，結果表明，f值的波動不大（表2）。

2.4 精密度試驗

重復進樣6次，測得樂果二級離子掃描色譜峰（125.0/79）平均峰面積為245 997，RSD為0.3%；敵敵畏二級離子掃描色譜峰（185.0/93.0）平均峰面積806 875，RSD為0.7%；毒死蜱二級離子掃描色譜峰（313.9/257.9）平均峰面積511 892，RSD為0.5%，精密度較好。

2.5 重復性試驗

試驗測得樂果二級離子掃描色譜峰（125.0/79.0）平均峰面積為246 081，RSD為0.5%；敵敵畏二級離子掃描色譜峰（185.0/93.0）平均峰面積806 593，RSD為0.6%；毒死蜱二級離子掃描色譜峰（313.9/257.9）平均峰面積511 427，RSD為0.4%，表明試驗重復性好。

2.6 樣品溶液穩(wěn)定性

取樣品加標溶液，分別在0、2、4、8、12、14、16、20、24 h進樣，結果表明，樂果二級離子掃描色譜峰（125.0/79.0）面積、敵敵畏二級離子掃描色譜峰（185.0/93.0）面積、毒死蜱二級離子掃描色譜峰（313.9/257.9）面積變化不大，RSD分別為0.9%、0.8%、0.6%，表明穩(wěn)定性良好。

2.7 最低檢出限

取樣品加標溶液，按測定條件測得樂果、敵敵畏、毒死蜱的信噪比（S/N）分別為10.72、658.14、853.77，以S/N的3倍計算最低檢出限、10倍計算最低定量限。結果測得樂果、敵敵畏、毒死蜱最低檢出限（以進樣量計）分別為1.39×10-2、2.27×10-4、1.75×10-4 ng；最低定量限（以進樣量計）分別為4.66×10-2、7.59×10-4、5.856×10-4 ng。

2.8 回收率試驗

試驗計算出樂果二級離子掃描峰面積和進樣量間的回歸方程得：A=615 047m-100.3（n=5，r=0.999 6），按回歸方程A=615 047m-102.4計算供試品中樂果含量；按校正方程A敵敵畏=615 047mf敵敵畏/樂果-102.4計算敵敵畏含量，按校正方程A毒死蜱=615 047mf毒死蜱/樂果

-102.4計算毒死蜱含量結果，樂果平均回收率為95.4%，RSD為1.5%（表3）；敵敵畏平均回收率為95.0%，RSD為1.1%（表4）；毒死蜱平均回收率為94.7%，RSD為0.9%（表5）。

2.9 樣品測定

分別取3個批號疊鞘石斛（批號為20161209-1、20161209-2、20161209-3）約50 g，粉碎成末過3號篩，分別精密稱定粉末約1 g，制備樣品溶液，取樣品溶液按測定條件分別進樣，記錄圖譜，測得樣品中樂果、敵敵畏、毒死蜱殘留量見表6。

3 討論

當色譜條件有細微改變時，相對保留時間有細微變化，但在該試驗中，被測定物質的定性主要采用二級離子碎片峰及其豐度比確認，所以對相對保留時間的耐受性沒有進行考察。

儀器建議進樣體積不超過1 μL，在相對校正因子f值耐受性考察時，對進樣體積0.9、1.0、1.1 μL時的f進行了比較，結果變化不大。

對多種藥材農藥殘留的含量測定進行了研究，發(fā)現(xiàn)由于中藥材含有多種成分，某些成分對測定會有一些干擾，所以在測定具體某一品種時應設計具體的試驗參數(shù)，并進行相應方法學論證。

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