蘇小潔，潘顯茂

（1.?？谑兴幤凡涣挤磻?yīng)監(jiān)測(cè)中心，海南 ?？?570311；2.海南省藥物研究所，海南 海口 570311）

山楂是薔薇科山楂屬核果類植物，又叫山里果或山里紅[1]。山楂的核質(zhì)硬，果肉薄，味微酸澀，其果實(shí)可生吃或制作成果脯、果糕。山楂經(jīng)干制后可入藥，具有調(diào)節(jié)血壓和血脂、增強(qiáng)心肌細(xì)胞和免疫系統(tǒng)的功能、促消化等功效[2]。研究發(fā)現(xiàn)，山楂中的黃酮類化合物具有較強(qiáng)的抗癌作用，能夠抑制人體內(nèi)癌細(xì)胞的生長、增殖及轉(zhuǎn)移[3]。黃曲霉毒素是由黃曲霉菌株生成的次生代謝產(chǎn)物。該物質(zhì)具有極強(qiáng)的毒性，可損傷人及動(dòng)物肝臟的功能，嚴(yán)重的可引發(fā)肝癌[4-5]。因此，檢測(cè)山楂干中黃曲霉毒素的含量十分必要。本次研究主要探討用免疫親和柱凈化-柱后衍生高效液相色譜熒光法檢測(cè)山楂干中黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2含量的效果。

1 儀器與試劑

本次實(shí)驗(yàn)使用的儀器是島津LC-20AT二元梯度高效液相色譜儀(包括SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20A柱溫箱、CBM-20A系統(tǒng)控制器、RF-20A熒光檢測(cè)器)、CRV-6A島津化學(xué)反應(yīng)單元系統(tǒng)、AUW220D島津電子天平、美國維康VICAM AflaTest黃曲霉毒素分析免疫親和柱。本次實(shí)驗(yàn)使用的試劑是黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（中國食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)：610001-201301，黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2的含量分別為0.04μg/ml、0.35μg/ml、1.18μg/ml、0.59μg/ml）、甲醇、乙腈、超純水。山楂干樣品購于超市，產(chǎn)自河北。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

本次實(shí)驗(yàn)的色譜柱是Agilent TC-C18（2）柱（250 mm×4.6 mm，5 um）， 其 流 動(dòng) 相 為 甲 醇 -乙 腈 -水（40:20:40），其流速為0.8 ml/min，其柱溫為40℃，其熒光激發(fā)的波長為360 nm，其發(fā)射波長為450 nm，其進(jìn)樣量為20 ul。色譜圖見圖1。

圖1 本次實(shí)驗(yàn)的色譜圖

2.2 進(jìn)行柱后碘衍生化的方法

本次實(shí)驗(yàn)使用的衍生溶液是濃度為0.05%的碘溶液（將0.5 g的碘加入到100 ml的甲醇溶液中進(jìn)行溶解，對(duì)此溶解液進(jìn)行稀釋、定容至1000 ml），衍生化泵的流速為0.3 ml/min，進(jìn)行碘衍生化處理的溫度為70℃。

2.3 制備對(duì)照品溶液的方法

精密量取0.5 ml的混合對(duì)照溶液（包含1.04μg/ml的黃曲霉毒素B1、0.35μg/ml的黃曲霉毒素B2、1.18μg/ml的黃曲霉毒素G1和0.59μg/ml的黃曲霉毒素G2），將其置于容量為10 ml的容量瓶中，用甲醇溶液將其稀釋至刻度，作為貯備溶液。精密量取1 ml的貯備溶液，將其置于容量為25 ml的容量瓶中，用甲醇將其稀釋至刻度，即得對(duì)照品溶液。

2.4 制備供試品溶液的方法

精密稱取15 g的山楂干供試品粉末（過二號(hào)篩），將其置于均質(zhì)瓶中。在均質(zhì)瓶中加入3 g的氯化鈉和75 ml濃度為70%的甲醇溶液。對(duì)此混合溶液進(jìn)行高速攪拌2 min，并進(jìn)行5 min的離心處理。精密量取15 ml的上清液，將其置于容量為50 ml的容量瓶中，對(duì)其進(jìn)行定容，并搖勻。用孔徑為0.45μm的微孔濾膜對(duì)混合溶液進(jìn)行濾過處理。取20.0 ml的續(xù)濾液，以3 ml／min的流速通過免疫親和柱，用20 ml的超純水進(jìn)行洗脫處理，棄去洗脫液。在剩余的溶液中持續(xù)打入空氣，將其中的超純水?dāng)D出免疫親和柱，再用少量的甲醇溶液對(duì)其進(jìn)行洗脫。收集洗脫液，將其置于容量為2 ml的容量瓶中，用甲醇溶液將其稀釋至刻度，并搖勻，即得供試品溶液。

3 結(jié)果

3.1 進(jìn)行線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

分別精密量取 5μl、10μl、15μl、20μl、25μl的混合對(duì)照品溶液，將這些混合對(duì)照品溶液注入到液相色譜儀中，測(cè)定峰面積。以峰面積（X）作為橫坐標(biāo)，以進(jìn)樣量（Y，ng）作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到黃曲霉毒素的線性回歸方程。黃曲霉毒素的線性回歸方程是：黃曲霉毒素B1:Y =0.0006X-0.3344（R2=0.9998），其線性范圍為0.6～50 pg；黃曲霉毒素B2:Y =0.0004X+0.0898（R2=0.9996），其線性范圍為0.1～15 pg；黃曲霉毒素G1:Y=0.0006X+0.1159（R2=1），其線性范圍為0.7～50 pg；黃曲霉毒素G2:Y=0.0006X-0.156（R2=0.9997），其線性范圍為0.2～15 pg。

3.2 進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

精密量取20μl的混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果顯示，黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2的峰面積RSD分別為0.7%、1.0%、0.8%、0.6%，表明本法的精密度良好。

3.3 進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

按照2.4中的方法制備供試品溶液。在供試品溶液中加入1.0 ml的混合對(duì)照品溶液。在2.1的色譜條件下，分別在第0 h、第2 h、第4 h、第16 h、第24 h時(shí)進(jìn)樣。結(jié)果顯示，黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2的峰面積RSD分別為1.2%、0.7%、0.9%、0.4%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.4 進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

按照2.4中的方法制備6份供試品溶液。在這6份供試品溶液中分別加入1.0 ml的混合對(duì)照品溶液。結(jié)果顯示，黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2的峰面積RSD分別為1.2%、1.7%、1.8%、2.0%，表明本法的重復(fù)性良好。

3.5 進(jìn)行檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

按照比例稀釋混合對(duì)照品溶液。當(dāng)信噪比為3：1時(shí)，將注入儀器中混合對(duì)照品溶液的量確定為檢測(cè)限。測(cè)得黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2的檢測(cè)限分別為0.2 pg、0.04 pg、0.2 pg、0.07 pg。

3.6 進(jìn)行加樣回收率實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

稱取同一批次的6份陰性樣品粉末，每份陰性樣品粉末的重量為15 g。在這些陰性樣品粉末中分別加入0.5 ml的對(duì)照品貯備液，按照2.4中的方法制備供試品溶液。進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算供試品溶液的加樣回收率。測(cè)得黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2的平均回收率分別為89.9%、86.2%、84.1%、79.4%。

3.7 進(jìn)行樣品含量測(cè)定的結(jié)果

取5 批樣品，每批樣品各15 g，按照2.4中的方法制備。進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算供試品溶液中黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2的含量。結(jié)果見表1。

表1 進(jìn)行樣品含量測(cè)定的結(jié)果（μg/kg）

4 討論

本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，在這5批山楂干樣品中，有1批山楂干樣品被檢出含有黃曲霉毒素B1。這批山楂干樣品中黃曲霉毒素B1的含量雖然未達(dá)到《藥典》中對(duì)黃曲霉毒素的限量（每1000 g藥材中含有黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G 1、黃曲霉毒素G2的總量不得超過10μg），但它提示我們，山楂干樣品有被黃曲霉毒素污染的可能。因此檢測(cè)山楂干中黃曲霉毒素含量十分必要。

綜上所述，免疫親和柱凈化-柱后衍生高效液相色譜熒光法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好,可用于測(cè)定山楂黃曲霉毒素的含量。