楊井泉，張云峰，高 磊，沈 敏

(新疆農(nóng)墾科學(xué)院 省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室，新疆 石河子 832000)

隨著我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，畜禽糞便排放不斷增加，由此產(chǎn)生的生態(tài)環(huán)境問題也變得日益突出。目前我國每年產(chǎn)生畜禽糞便排放總量高達(dá)38億噸，而綜合利用率和無害化處置率只有分別不到60%和50%[1]，仍有40%未得到有效處理和利用，給周邊環(huán)境和居民生活帶來不利的影響，已成為農(nóng)業(yè)面源污染的主要來源。畜禽糞便富含纖維素、粗蛋白等有機(jī)質(zhì)和一定的礦物質(zhì)和微量元素，可作為生產(chǎn)有機(jī)肥料的原料[2]。

生物堆肥是養(yǎng)殖場固體廢棄物資源化利用的主要手段，具有投資小、效益高、可以使大量有機(jī)固體廢棄物重復(fù)資源化利用等優(yōu)點，但存在發(fā)酵周期長、產(chǎn)生臭味、纖維素木質(zhì)素等分解不徹底、肥效低等缺陷[3]。堆肥是由群落結(jié)構(gòu)演替非常迅速的多個微生物群體共同作用而實現(xiàn)固體廢物資源化、無害化的一個動態(tài)過程，微生物在其中發(fā)揮了主要作用，是決定堆肥發(fā)酵周期長短和臭味大小的關(guān)鍵因素。如果在堆肥基質(zhì)中添加可加快基質(zhì)分解速度并能除臭的微生物組合，則既能加快堆肥腐熟進(jìn)程又能有效地減少臭味的逸出，對于提高堆肥產(chǎn)品質(zhì)量和控制環(huán)境污染具有重要作用[4-6]。

本試驗以某生物濾池樣品為菌源進(jìn)行纖維素酶活性測定和除臭試驗，分離篩選出有一定除臭功能高效纖維素降解菌株，并對其生理生化特征和分子水平的種屬進(jìn)行鑒定，以期為進(jìn)一步開發(fā)用于養(yǎng)殖廢棄物堆肥處理的復(fù)合微生物菌劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌源樣品采自某垃圾處理廠生物濾池。標(biāo)準(zhǔn)菌株綠色木霉(40502)由新疆天物生態(tài)科技股份有限公司惠贈。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

(1)赫奇遜(Hutchinson)氏培養(yǎng)基：用于纖維素降解菌株的富集培養(yǎng)。KH2PO41.0 g、NaCl 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、NaNO32.5 g、FeCl30.001 g、CaCl20.1 g，無淀粉濾紙1張剪碎加入，攪拌并定容至1 000 mL，pH7.2左右，121 ℃高壓滅菌 15 min。

(2)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：用于細(xì)菌的分離培養(yǎng)。牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g，瓊脂15-20 g，加水溶解并定容至1 000 mL，pH7.4～7.6。121 ℃高壓滅菌20 min。

(3)羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基(CMC-Na培養(yǎng)基)：用于纖維素降解菌的篩選。羧甲基纖維素鈉(CMC- Na)20 g、Na2HPO42.5 g、KH2PO41.5 g、蛋白胨2.5 g、酵母膏0.5 g、H2O 1 000 mL，瓊脂20 g，pH 7.0～7.2，121 ℃高壓滅菌15 min。

(4)發(fā)酵培養(yǎng)基：用于測定酶活。麩皮5.0 g，蛋白胨0.5 g，Mandel's無機(jī)鹽營養(yǎng)液100 mL，121 ℃滅菌20 min。

(5)生孢培養(yǎng)基：蛋白胨1.0 g、酵母膏0.7 g、(NH4)2SO40.2 g、Mg SO4·7H2O 0.2 g、K2HPO41.0 g，瓊脂20 g，加H2O至 1 000 mL，pH 7.0～7.2。121 ℃高壓滅菌15 min。傾入無菌直形試管制成斜面。

(6)革蘭氏碘液：碘化鉀2.0 g，碘1.0 g，加蒸餾水300 mL。用于纖維素水解圈的測定。

(7)DNS 試劑(3,5-二硝基水楊酸)、檸檬酸緩沖液、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液等按照QB 2583- 2003標(biāo)準(zhǔn)配制。

(8)NH3選擇性培養(yǎng)基：稱取蔗糖50.0 g、KH2PO42.0 g、MgSO40.5 g、FeSO40.1 g、1%ZnSO45.0 mL、NaCl 2.0 g，加蒸餾水1 000 mL充分溶解后。按照每瓶10 mL的量分裝于50 mL三角瓶中，高壓滅菌。接菌前每瓶分別加入100 μL氨水，搖勻備用。

(9)Na2S選擇性培養(yǎng)基：KH2PO42 g、NH4Cl 0.4 g、Na2CO30.2 g、MgCl2·6H2O 0.2 g，瓊脂18 g，加蒸餾水1 000 mL充分溶解，pH 7.0，高壓滅菌。待在培養(yǎng)基冷卻至40～50 ℃左右，加入10 g硫化鈉，迅速混合均勻，倒平板。

1.3 方 法

1.3.1 纖維素降解細(xì)菌的分離 稱取10 g樣品置于無菌三角瓶，加入100 mL生理鹽水?dāng)嚢杈鶆蚝?，? mL懸液加入盛有 50 mL赫奇遜氏培養(yǎng)基的三角燒瓶，30 ℃、150 rpm條件下培養(yǎng)30 min以進(jìn)行纖維素降解菌的富集。將富集后的培養(yǎng)液進(jìn)行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍的梯度稀釋，分別取100 μL稀釋液涂布牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。挑取形態(tài)不同的單菌落分別接種牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，純化培養(yǎng)后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 CMC水解圈測定 取分離菌株的液體培養(yǎng)物各5 μL，分別點種CMC培養(yǎng)基，30 ℃恒溫倒置培養(yǎng)1 d。取出培養(yǎng)板，加入革蘭氏碘液浸染3～5 min。觀察菌落周圍有無明顯水解圈，并測量水解圈直徑(H)與菌落直徑(C)，計算H/C比值，根據(jù)H/C比值大小初步確定分離菌株纖維素酶活力的高低。

1.3.3 分離菌株纖維素酶活力測定 選取H/C比值較大的分離菌株以及標(biāo)準(zhǔn)菌株，分別接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃、150 rpm振蕩培養(yǎng)4 d，3 000 rpm離心10 min，收集上清液，進(jìn)行纖維素酶活性測定。測定指標(biāo)包括：①纖維素酶總活性：采用濾紙酶活性(FPA)檢測法；②外切β-1,4-葡萄糖苷酶(簡稱CBH或C1酶)活性：采用微晶纖維素(MCC)酶活性測定法；③內(nèi)切β-1,4-葡萄糖苷酶(簡稱EG或Cx酶)活力檢測：采用羧甲基纖維素(CMC)酶活性測定法；④β-葡萄糖苷酶(簡稱BG)活性：采用Barush和Swiain法[7]，以水楊酸苷作底物。酶活力單位用IU/mL表示，即每mL 酶液在1 min內(nèi)使底物降解產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需的的酶量。

1.3.4 分離菌株的除臭能力檢測

1.3.4.1 氨水和硫化鈉利用情況 將分離菌株分別接入加有100 μL氨水的10 mLNH3選擇性液體培養(yǎng)基中，用封口膜密封瓶口后，28 ℃、150 rpm震蕩培養(yǎng)1 d。觀察菌液的變化，菌液混濁說明菌株能夠直接利用NH3，菌液保持透明則說明菌株不能直接利用NH3。

將分離菌株分別劃線接種于加有硫化鈉的選擇性固體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)1 d。觀察不同菌株的生長情況，能夠生長的菌株說明其具有利用和降解硫的能力。

1.3.4.2 豬糞除臭效果檢測 將分離菌株分別接入10 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，28 ℃、150 rpm條件下培養(yǎng)1 d。稱取新鮮豬糞50.0 g，裝入1 000 mL燒杯中，加入5 mL培養(yǎng)菌液和5 mL無菌水，混合均勻。每個菌株做6個重復(fù)，其中3個用于氨氣濃度測定，3個用于硫化氫濃度測定。同時設(shè)一組只加無菌水的空白對照。在測氨的大燒杯中，放入裝有20 mL硼酸溶液的50 mL小燒杯；在測硫化氫的大燒杯中，放入裝有20 mL鋅銨絡(luò)鹽溶液的50 mL小燒杯。將大燒杯口密封后，室溫(25 ℃)放置。5 d后取出小燒杯中的吸收液，通過硼酸吸收凱氏法測定氨氣釋放量，亞甲基藍(lán)分光光度法測定硫化氫釋放量，進(jìn)一步檢測菌株清除NH3和H2S的能力。同時換入新加入20 mL硼酸溶液或鋅銨絡(luò)鹽溶液的50 mL小燒杯。如此每隔5 d進(jìn)行一次測定，到第20 d為止。

1.3.5 篩選菌株菌落形態(tài)及生理生化鑒定 根據(jù)分離菌株的菌落形態(tài)特征及生理生化特征，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》(第八版)[8]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9]進(jìn)行菌種初步鑒定。

將篩選菌株在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，得到單菌落，觀察分離菌株的菌落形態(tài)特征，包括菌落形狀、大小、顏色、邊緣、透明度、表面、隆起形狀及培養(yǎng)基顏色變化等。挑取單菌落，進(jìn)行革蘭氏染色、菌體芽孢染色并鏡檢。

將篩選菌株劃線接種于生孢培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)4～7 d。常規(guī)涂片，革蘭氏染色，油鏡觀察菌體是否形成芽孢。

生理生化鑒定主要進(jìn)行糖類發(fā)酵試驗和碳源利用試驗。

1.3.6 篩選菌株的16S rDNA 序列鑒定 提取分離細(xì)菌的基因組總DNA，擴(kuò)增16S rDNA的V3-V4區(qū)保守序列，PCR上下游引物序列分別為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。 PCR 反應(yīng)體系為50 μL：DNA模板15 ng，上下游引物(10 uM)各2 μL，dNTPs(2.5 mM)4 μL，10×PCR buffer 5 μL，Taq DNA聚合酶(2.5 U/μL，TaKaRa)0.3 μL，ddH2O補(bǔ)充至50 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，循環(huán)30 次；72 ℃ 10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，電泳檢測合格后切膠回收，送生工測序。利用DNASTAR 5.0軟件分析測序結(jié)果，并與GenBank中的相關(guān)序列進(jìn)行Blast比對，初步判定各菌株的種屬。

1.3.7 篩選菌株的安全性檢驗 分別吸取候選菌株的培養(yǎng)菌液0.2 mL，接種1月齡京白小鼠，每株菌液接種3只小鼠。同時設(shè)3只對照小鼠。維持正常飼養(yǎng)狀態(tài)。每天觀察并記錄小鼠的精神狀態(tài)以及飲食情況，連續(xù)觀察5 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌的初篩結(jié)果

菌源樣品經(jīng)過富集培養(yǎng)、菌種分離，共獲得38株細(xì)菌。利用CMC瓊脂培養(yǎng)基和Grans's碘液染色法，對分離菌株進(jìn)行纖維素酶活性初篩，結(jié)果共有21株細(xì)菌產(chǎn)生了清晰的水解圈，其水解圈直徑與菌落直徑比值(H/C比值)介于1.86～5之間，說明這些菌株均能產(chǎn)生一定量的纖維素酶。表1所示為部分纖維素降解菌的初篩結(jié)果。由表1知，菌株X-1和X-6的水解圈直徑(H)和H/C比值相對較高，提示這兩個菌株的纖維素酶降解能力相對較強(qiáng)。

表1 部分纖維素降解菌的初篩結(jié)果Table 1 The initial screening results of some cellulose degradation bacteria

2.2 纖維素降解菌纖維素酶活性檢測結(jié)果

試驗進(jìn)一步對21個初篩菌株的纖維素酶活性進(jìn)行了測定。部分菌株檢測結(jié)果如表2所示，其中菌株X-1和X-6的纖維素酶總活性(FPA)及纖維素酶主要組分Cen、Cex、BG的酶活性均高于標(biāo)準(zhǔn)菌株綠色木霉，確定為纖維素酶活性較高的分離菌株。

2.3 分離菌株的除臭能力檢測

2.3.1 氨水和硫化鈉利用情況 如表3所示，菌株X-1能夠在添加硫化鈉的培養(yǎng)基中生長，但在添加氨水的培養(yǎng)基中不生長，說明該菌株可以利用硫化鈉；菌株X-6能夠在添加氨水培養(yǎng)基上生長，而在添加硫化鈉的培養(yǎng)基上不生長，說明該菌株可以利用氨水作為氮源；菌株X-2、X-3和X-20對氨水和硫化鈉均不能利用。菌株X-1和X-6可利用硫或氮的培養(yǎng)特性提示其在清除NH3和H2S方面可能具有一定作用。

表2 部分菌株的纖維素酶活性檢測結(jié)果Table 2 Test results of cellulase activity in partial isolated strains IU/mL

表3 部分分離菌株的氨水和硫化鈉利用情況Table 3 Utilization of NH3 and Na2S in partial isolated strains

2.3.2 豬糞除臭效果檢測結(jié)果 如表4所示，2個分離菌株分別對豬糞中的H2S和NH3具有一定的清除能力。菌株X-1對豬糞中的H2S 和NH3均具有較高的清除率，接種20 d后對H2S和NH3的清除率分別達(dá)到44.56%和29.13%；菌株X-6則可有效利用NH3，接種20 d后對NH3的清除率達(dá)到41.87%，但對H2S沒有明顯的清除效果。

2.4 菌株X-1、X-6的初步鑒定

2.4.1 菌株的形態(tài)特征及生理生化特性 菌株X-1菌落呈乳白色凸起，圓形，不透明，表面光滑，邊緣整齊。革蘭氏染色呈陽性小桿菌(圖1A)；在生孢培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d后，經(jīng)革蘭氏染色、油鏡觀察，可見有大量芽孢形成(圖1B)。芽孢位于菌體中部，呈橢圓形，直徑大于菌體直徑，使得整個菌體膨脹呈梭形。生化鑒定結(jié)果表明，菌株X-1能利用試驗所選所有糖類物質(zhì)。如表5所示，X-1能分解果糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣；能分解葡萄糖、蔗糖、甘露醇、鼠李糖、棉子糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。說明X-1可利用較多糖類物質(zhì)作為碳源和能源，但分解糖的能力有一定差異。酶類試驗結(jié)果(表6)表明，菌株X-1產(chǎn)生淀粉酶和過氧化氫酶，不產(chǎn)生脲酶、氧化酶和脂肪酶；不產(chǎn)生明膠酶；接種三糖鐵瓊脂的斜面和底面都為黃色，說明菌株X-6可產(chǎn)生乳糖，不產(chǎn)生H2S；不產(chǎn)生黑色素；耐鹽試驗結(jié)果表明，菌株X-1可耐受1%氯化鈉。

表4 篩選菌株NH3和H2S清除能力檢測結(jié)果Table 4 Test results of the absorbance of NH3 and H2S in isolated strains

圖1 菌株 X-1、X-6的革蘭氏染色和芽孢形成結(jié)果(100×) A、C：菌株 X-1、X-6在常規(guī)培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d后菌落的革蘭氏染色結(jié)果；B、D：菌株 X-1、X-6在生孢培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d后菌落的革蘭氏染色結(jié)果，箭頭所指為芽孢Fig.1 The results of Gram's stain and spore formation of strains X-1 and X-6 A and C: The results of Gram's stain of colonies of X-1 and X-6 cultivated in routine medium B and D: The results of Gram's stain of colonies of X-1 and X-6 cultivated in sporulation medium for 4 days

菌株X-6菌落呈乳白色凸起，圓形，不透明，表面光滑，邊緣整齊。革蘭氏染色呈陽性小桿菌(圖1C)；在生孢培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d后，經(jīng)革蘭氏染色、油鏡觀察，可見有大量芽孢形成(圖1D)。芽孢位于菌體中部，呈圓柱形，直徑小于菌體直徑。生化鑒定結(jié)果表明，菌株X-6能利用試驗所選部分糖類物質(zhì)作為碳源和能源。如表5所示，X-6能分解葡萄糖、蔗糖和木糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；能輕微利用棉子糖；不能利用果膠、甘露醇、果糖和鼠李糖。酶類試驗結(jié)果(表6)表明，菌株X-6產(chǎn)生淀粉酶和過氧化氫酶，不產(chǎn)生脲酶、氧化酶、脂肪酶和明膠酶；接種三糖鐵瓊脂的斜面和底面都為黃色，說明菌株X-1可產(chǎn)生乳糖，不產(chǎn)生H2S；不產(chǎn)生黑色素；耐鹽性一般，可耐受1%氯化鈉。

2.4.2 篩選菌株的16S rDNA 序列鑒定 以篩選菌株X-1、X-6基因組總DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增均獲得長度為1 516 bp的DNA片段。 將篩選菌株的測序結(jié)果分別輸入GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對。分析結(jié)果表明，菌株X-1的V3-V4區(qū)擴(kuò)增序列與燦爛類芽孢桿菌(Paenibacilluslautusstrain12S5，KM374740.1)相似度為99%，初步確定菌株X-1屬于類芽孢桿菌屬中的燦爛類芽孢桿菌(Paenibacilluslautus)[8-9]。菌株X-6的V3-V4區(qū)擴(kuò)增序列與煙酸芽胞桿菌(BacillusniacinistrainBM1C4，EU221335)相似度為99%，初步確定菌株X-6屬于芽孢桿菌屬中的煙酸芽胞桿菌(Bacillusniacini)[8-9]。

2.4.3 篩選菌株的安全性檢驗 試驗小鼠在接種菌株X-1、X-6的培養(yǎng)菌液后，除注射當(dāng)天表現(xiàn)輕微的應(yīng)激性沉郁外，后續(xù)幾天均再無異常表現(xiàn)。接種5 d后，將試驗小鼠脫頸致死進(jìn)行解剖，接種小鼠組織器官未發(fā)現(xiàn)如何異常。說明2個分離菌株均為安全菌株。

表5 分離菌株的碳源利用檢測結(jié)果Table 5 The results of utilization of the carbon sources of the screened strains

表6 分離菌株的生化特征Table 6 The biochemical characteristics of the screened strains

綜上所述，試驗最終分離篩選出兩株具有較高纖維素酶活性和一定除臭功能的環(huán)境友好型細(xì)菌，根據(jù)兩個菌株的菌落形態(tài)、生理生化特征以及基于16S rDNA序列的分子鑒定結(jié)果，初步鑒定菌株X-1屬于類芽孢桿菌屬中的燦爛類芽孢桿菌(Paenibacilluslautus)，菌株X-6屬于芽孢桿菌屬中的煙酸芽胞桿菌(Bacillusniacini)。

3 討 論

有關(guān)纖維素降解菌的定性篩選，國內(nèi)目前主要是利用羧甲基纖維素(CMC)為底物結(jié)合0.1%剛果紅特異性染色的方法[10-11]。剛果紅在CMC培養(yǎng)基上的浸染時間為15～20 min，較為快速。但剛果紅是一種聯(lián)苯胺類染料，存在致癌風(fēng)險[12]，且對菌株生長和纖維素酶產(chǎn)量有一定影響[13]。2008年，Kasana等[13]首次報道了利用革蘭氏碘液染色篩選纖維素降解菌的方法，革蘭氏碘液能夠與CMC培養(yǎng)基中的纖維素結(jié)合形成烏青色的復(fù)合物，而與被水解的纖維素則不結(jié)合，從而在產(chǎn)纖維素酶菌株菌落周圍形成一個顏色差異明顯、邊緣清晰的水解圈。本試驗采用CMC培養(yǎng)基結(jié)合革蘭氏碘液染色方法，在較短時間內(nèi)完成了產(chǎn)纖維素酶候選菌株的定性篩選，并根據(jù)水解圈直徑與菌落直徑比值(H/C比值)大小初步篩選出2株纖維素酶產(chǎn)生能力相對較強(qiáng)的菌株。而且從進(jìn)一步的纖維素酶活性檢測數(shù)據(jù)來看，初篩結(jié)果和定量檢測結(jié)果趨勢基本一致，具有很好的參考價值。整個染色過程只需要3～5 min，相對于剛果紅染色，該方法更為安全、有效、方便、快捷，值得推廣。

試驗重點對分離菌株的纖維素酶活性進(jìn)行了檢測，期望得到產(chǎn)酶量高、酶系組成比較齊全的安全菌株。結(jié)果表明，分離菌株X-1、X-6的3個主要的纖維素酶組分C1、Cx和BG的酶活都比較高，其中X-1的C1、Cx和BG酶活均在100 IU/mL以上，纖維素酶總活性(FPA)分別為77.97和70.95 IU/mL，纖維素酶活性接近[10，15]或高于[13]部分文獻(xiàn)所報道的分離菌株，而低于金迪等[16]的文獻(xiàn)報道。另外，從生理生化試驗結(jié)果來看，兩個分離菌株除了高產(chǎn)纖維素酶外，還可產(chǎn)生淀粉酶和過氧化氫酶。纖維素酶和淀粉酶是飼用復(fù)合酶制劑的兩個重要組分[17]，由于淀粉酶活性不是本次試驗關(guān)注的重點，因此未做進(jìn)一步研究。在養(yǎng)殖環(huán)境治理過程中，除臭是涉及空氣污染的一個重要治理環(huán)節(jié)。簡保全等[18]針對H2S和NH3在糞便堆肥過程中的釋放特點進(jìn)行的研究表明，H2S的產(chǎn)生主要集中在升溫期和高溫期初期(1～13 d)，NH3的揮發(fā)主要集中在升溫期和高溫期(1～20 d)，即堆肥的前20 d是H2S和NH3的主要釋放期。本次分離菌株通過新鮮豬糞除臭試驗結(jié)果表明，在接種第15～20 d，菌株X-1 和X-6分別對H2S和NH3表現(xiàn)出較好的脫臭功能，是兩株兼具纖維素降解和除臭功能的環(huán)境友好型細(xì)菌。后續(xù)將對這兩個分離菌株的功能做進(jìn)一步試驗研究，同時繼續(xù)篩選纖維素降解菌株和除臭菌株，為最終開發(fā)復(fù)合菌劑，實際應(yīng)用于養(yǎng)殖廢棄物環(huán)境污染治理奠定技術(shù)基礎(chǔ)。