李云龍，高 峰，張海濤，顧開朗

(徐州生物工程職業(yè)技術學院，江蘇 徐州 221006)

溶菌酶(Lysozyme，LYZ)全稱為1,4-β-N-溶菌酶，又稱粘肽N-乙?；邗Ｋ饷?，能夠特異水解細菌細胞壁中肽聚糖N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之間的β-1，4-糖苷鍵，是一種具有抗菌、溶菌活性的固有免疫效應分子[1]。目前在高等反芻動物(如牛、羊和鹿等)基因組中存在大概10種溶菌酶相似基因[2]。反芻動物雖然有眾多溶菌酶基因，但相對于其他動物機體缺乏溶菌酶[3]。此外，不同組織溶菌酶表達差異巨大，牛腎、血液、淚液、乳汁中溶菌酶表達水平低于大多數(shù)動物[4]，牛溶菌酶在乳腺中水平較低，僅為0.05～0.13 mg/L，相比之下，人乳腺溶菌酶表達量可比其高2000～4000倍[5]。本研究選擇原核大腸桿菌表達系統(tǒng)，對奶牛乳腺溶菌酶基因進行克隆表達，以期獲得高效表達的奶牛溶菌酶載體，為奶牛溶菌酶的開發(fā)利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料

限制性內切酶NcoI、XhoI購自Fermentas公司，表達載體pET32T，T4 DNA Ligase，2×Taq Master Mix，PCR產物回收試劑盒，膠回收試劑盒，DL5 000 bp Marker，大腸桿菌TOP10菌株，中分子量蛋白Marker，6×His標簽蛋白純化試劑盒(Ni-IDA)，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自ProbeGene公司，寡核苷酸合成以及DNA測序服務由上海生工提供， SDS，異丙基硫代半乳糖苷-誘導劑(IPTG)購自Amersco公司，Acr、Bis、Tris購自Sigma公司，TEMED購自BIO-RAD公司，人溶菌酶標品購自Merck公司，其它常規(guī)試劑從國藥集團采購。

1.2 試驗方法

1.2.1 LYZ基因cDNA鏈的合成 根據(jù)已知的奶牛LYZ基因mRNA序列(NCBI Reference Sequence:NM_001077829.1)，用Primer Premier 6.0軟件將其翻譯為cDNA序列，并由上海生工公司合成。序列為：CCATGGCTAAGAAATTTCAGCG TTGTGAGCTGGCGCGGACGCTGAAAA AGCTGGGGCTGGACGGCTACCGGGGCGTGAGTTT>AGCAAACTGGGTTTGTCTGGCACGTTGGGA GAGTAATTATAATACGAGAGCAACAAATT>ACAACCGTGGTGATAAAAGCACAGATTATG GTATTTTTCAGATCAATAGCCGTTGGTGGT GTAATGATGGGAAAACACCGAAAGCAGTGA ATGCATGTCGGATTCCGTGTAGCGCACTGCT GAAAGATGATATCACCCAGGCGGTTGCATG TGCGAAGCGCGTTGTGAGAGATCCCCAGGGG ATTAAAGCATGGGTTGCATGGCGTAACAAA TGTCAAAATAGAGACCTGAGAAGCTACGTG CAGGGGTGTCGGGTTTAACTCGAG。其中CC ATGG為引入的NcoI酶切位點、CTCGAG為引入的XhoI酶切位點。

1.2.2 酶切反應 采用雙酶切獲得目的片段，以下體系放入37 ℃恒溫水浴鍋中反應2 h后，膠回收獲得載體片段和目標片段。pET32T載體采用NcoI、XhoI雙酶切線性化后通過膠回收獲得載體片段。酶切反應體系為：目的片段酶切體系50 μL：目的片段1 μg，10×FD Buffer 5 μL，NcoI1 μL (10 u/μL)，XhoI1μL (10 u/μL)，加ddH2O至50 μL。載體的酶切體系50 μL：載體1 μg，10×FD Buffer 5 μL，NcoI1 μL (10 u/μL)，XhoI 1 μL (10 u/μL)，加ddH2O至50 μL。

圖1 pET32T克隆和表達區(qū)域T7啟動子;乳糖操縱子;T7終止子;Trx標簽;His標簽;:T7終止子引物;凝血酶;腸激酶Fig.1 pET32T cloning and expression region T7 promoter;lac operator;T7 terminator;Trx·Tag;His·Tag;T7 terminator primer;thrombin;enterokinase

1.2.3 連接反應 將上述回收純化好的目的DNA片段和載體片段，進行連接，按下述反應體系22℃在PCR儀中連接反應1 h。反應體系如下：載體片段4 μL，目的基因片段8 μL，10×T4 DNAligase Buffer 2 μL，T4 DNAligase 1 μL (400 u/μL)，加ddH2O至20 μL。

1.2.4 重組質粒的轉化、篩選和鑒定 挑選單菌落生長后用T7通用引物PCR擴增篩選陽性克隆。T7通用引物：T7上游引物5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'，T7下游引物5'-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'。PCR擴增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30循環(huán)；72 ℃ 2 min，4 ℃保存。PCR產物瓊脂糖凝膠檢測并測序。挑選單菌落提取質粒，采用NcoI、XhoI雙酶切驗證條帶大小，反應體系如下：載體1 μg，10×FD Buffer 5 μL，NcoI1 μL (10 u/μL)，XhoI1 μL (10 u/μL)，加ddH2O至50 μL。37 ℃水浴鍋中反應2 h。酶切產物用瓊脂糖凝膠檢測。

1.2.5 融合蛋白pET32T-LYZ 的表達和分析 挑取單克隆接種至新鮮的LB液體培養(yǎng)基(含50 mg/L氨芐)37 ℃培養(yǎng)約4 h，OD600為0.6左右，加入終濃度為0.6 mM的IPTG誘導pET32T-LYZ的表達。37 ℃誘導兩個小時后收集菌體，處理后的菌體蛋白樣品進行13%SDS-PAGE電泳。

1.2.6 重組蛋白的純化及濃度測定 把重組蛋白凝膠浸泡在0.25 mol/L的KCL溶液中10 min，將含有目的蛋白的凝膠切下放入透析袋中，并加入10 mL Tris-甘氨酸緩沖液，120 V電泳2 h，再反置透析袋繼續(xù)電泳10 min，目的蛋白用pH 7.5的磷酸鹽緩沖液放置在4 ℃冰箱中透析過夜，紫外分光光度計測定其濃度。

1.2.7 酶標儀快速比濁法測定LYZ活性 本試驗參照蒼金榮[6]建立的快速比濁法檢測溶菌酶活性，用PBS將人溶菌酶標準品配成活力為5 000、4 000、3 000、2 000、1 000 U/mL的標準液；以陰性菌株表達上清為對照，將不同濃度標準液和陽性菌株表達上清各取100 μL加入到酶標板中，迅速加入100 μL溶壁微球菌的菌懸液，37 ℃恒溫作用5 min后測其吸光度A490。以標準液活性為縱坐標，吸光度A490平均值為橫坐標繪制標準曲線y=ax+b，樣品吸光度平均值代入方程得出樣品的活性。

2 結果與分析

2.1 PCR篩選陽性克隆鑒定結果

隨機挑選單菌落用pET32T載體的T7通用引物進行PCR擴增，擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1 000 bp位置處出現(xiàn)明亮條帶(圖2)，與預期產物大小一致，表明克隆結果為陽性。提取3號質粒進行測序驗證，測序結果見圖3，與目的片段的序列完全一致。

2.2 重組陽性克隆酶切驗證

挑選單個菌落并提取質粒，用NcoI、XhoI雙酶切驗證條帶大小，如圖4。得到與理論值400 bp相符的條帶，說明LYZ基因已成功克隆至pET32T載體中。

2.3 表達產物的鑒定及濃度測定

SDS-PAGE電泳圖片顯示(圖5)，在IPTG誘導后，出現(xiàn)一條約為33 kD的蛋白條帶，與理論分子量相當，表明LYZ蛋白表達成功。用紫外分光光度計檢測切膠純化后的重組蛋白質，其濃度為223 mg/L。

2.4 溶菌酶活性分析

溶菌酶活性與吸光度A490的線性回歸方程為Y=6437.5-6899.5×A490，進行多次重復性檢測，測得的A490值為0.623±0.00024，將其帶入方程得到溶菌酶溶液的活性為2 139 U/mL。LYZ活性標準曲線見圖6。

圖2 LYZ-pET32T菌落PCR鑒定 M：DL5000bp DNA Marker；1-6：不同的克隆Fig.2 Analysis of bacterial colony of LYZ-pET32T by PCR

圖3 LYZ-pET32T菌落測序結果Fig.3 Sequencing results of bacterial colony of LYZ-pET32T

圖4 LYZ-pET32T限制性酶切驗證結果 M：DL5000bp DNA Marke；1：酶切前質粒；2：雙酶切質粒Fig.4 The result of restriction enzyme digestion of LYZ-pET32T M：DL5000bp DNA Marke；1：Plasmid before digestion ； 2：Plasimd of double digestion

圖5 表達及純化產物的SDS-PAGE分析 1.未誘導；2.菌株1誘導后；3.菌株2誘導后； M.中分子量蛋白MarkerFig.5 SDS-PAGE profile of expressed and purified LYZ 1. non-induced;2. strain 1 after induced; 3. strain 2 after induced;M. Marker of moderate

3 討 論

溶菌酶作為哺乳動物機體防御因子的重要成員，在食品、工業(yè)和醫(yī)學中有巨大的應用。在飼料生產與家畜飼養(yǎng)中，配合其他添加劑可以延長飼料的貯存期，同時又可以預防和治療動物消化道腹瀉等疾病。邢思華等[7]在基礎飼料中添加溶菌酶制品飼喂草魚,對草魚生長性能和抗感染能力有顯著影響。在獸醫(yī)臨床方面，可以用于預防和治療奶牛的乳房炎、陰道炎、皮膚潰瘍、急慢性子宮內膜炎等細菌感染性疾病。很多學者嘗試將具有較高活性的人溶菌酶基因轉入到奶牛[8]和奶山羊[9]，使牛、羊乳腺分泌表達人溶菌酶，從而提高對乳房炎的抵抗力。楊睿等[10]用不同來源的四種溶菌酶對引起奶牛乳房炎的葡萄球菌做抑菌試驗，并從中篩選出抑菌效果最好的樣品。沈誠等[11]構建人的溶菌酶基因表達載體，將其注入患有乳房炎的奶牛的乳腺組織，其治愈率(97.4%)顯著高于傳統(tǒng)藥物組(69.2%)。本試驗將奶牛溶菌酶作為一種新型的內源性藥物通過飼喂和注射來預防和治療奶牛乳房炎，不僅能夠有效遏制濫用抗生素導致的一系列問題，而且不會對人產生免疫原性，對于動物抗病育種意義重大。本試驗所獲得的重組奶牛溶菌酶其本質屬于轉基因產品，長期使用這類藥物的安全性問題還需進一步評估。

溶菌酶在真核系統(tǒng)和原核系統(tǒng)中表達的報道有很多，齊長學[12]構建酵母分泌型表達載體pPICZαA-LYZ1，并在受體菌BL21(DE3)和GS115中成功表達，章歡[13]將牛溶菌酶基因已克隆到原核表達載體pGEX-4T-1上，并轉化大腸桿菌BL21，同樣獲得了良好的表達效果，有學者認為溶菌酶對大腸桿菌有較強的殺菌作用，對宿主菌有一定毒性，致使溶菌酶在大腸桿菌中無法直接表達。從本試驗的結果看，表達的蛋白以無活性的包涵體形式存在，很好地避免了上述問題，后續(xù)可以利用簡單的超聲裂解和離心方法即可獲得純化的重組蛋白，便于后期研究重組蛋白質的生物學活性。

本研究在獲得目的基因CDS序列時，采用的是人工設計并合成的方法，這與付世新等[14]所采用的方法一致，而王洪亮[15]在獲得LYZ基因CDS序列時，采用了RT-PCR的方法，結果某些亞型溶菌酶基因由于表達量很低沒有克隆成功。本試驗決定采用人工合成的方法獲得目的基因片段，主要原因有三點：第一，目的片段堿基含量較少，用合成的方法可以大大降低成本；第二，合成的片段是高保真的，不會因為采樣時個人的差異造成堿基的突變；第三，可以在合成的片段上加以修飾，增加一些酶切位點，方便后續(xù)的連接反應。

4 結 論

本研究成功構建原核表達載體LYZ-pET32T，通過誘導獲得了高效表達的奶牛溶菌酶蛋白，并檢測了活性，為奶牛溶菌酶的應用奠定了基礎。