呂慧嬌，康路路，張 萌，閆娜娜，張經(jīng)緯，高文昌，徐坤，張智英

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

鯉春病毒血癥病毒(Spring Viremia of Carp Virus，SVCV)是主要危害鯉科魚(yú)類(lèi)，能夠引發(fā)感染鯉春病毒血癥(SVC)的一種彈狀病毒[1]，是影響鯉科魚(yú)生產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的主要病毒之一。感染SVCV的魚(yú)體會(huì)出現(xiàn)腹部膨大、皮膚和鰓部出現(xiàn)血色斑點(diǎn)等癥狀[2]。SVC已被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(Office international des épizooties，OIE)列為必須申報(bào)的疾病之一，也被中國(guó)農(nóng)業(yè)部列為《中華人民共和國(guó)進(jìn)境動(dòng)物》二類(lèi)動(dòng)物疫病，是魚(yú)類(lèi)口岸檢疫的主要對(duì)象之一[3-4]。SVCV最早由Fijian等[5]研究分離出來(lái)，屬?gòu)棤畈《究?、水泡性病毒屬的單股?fù)鏈RNA病毒[6-7]。2003年，有人首次在國(guó)內(nèi)分離出SVC可疑毒株，并用特異性引物擴(kuò)增出了陽(yáng)性片段[8]。自2001年，SVCV(VR-1390)的第一個(gè)全基因組核苷酸序列被揭示后，GenBank中共有5個(gè)SVCV的全基因組序列[9]。SVCV基因組序列全長(zhǎng)約為11 kb[10]，含有5個(gè)主要的開(kāi)放閱讀框(ORFs)，分別編碼物種蛋白，分別為：核蛋白(Nucleoprotein，N)、磷蛋白(Phosphoprotein，P)、基質(zhì)蛋白(Matrix protein，M)、糖蛋白(Glycoprotein，G)和RNA聚合酶(polymerase，L)，其ORFs的排列次序?yàn)?'-N-P-M-G-L-5'[11]。其中，糖蛋白(G)位于SVCV囊膜表面，是最主要的表面抗原，能夠誘導(dǎo)引起魚(yú)體產(chǎn)生中和抗體，參與病毒的感染[12]、免疫識(shí)別[13]、和介導(dǎo)病毒的內(nèi)吞作用[14]等，可作為SVCV免疫診斷的抗原，同時(shí)也是抗病毒藥物的理想靶點(diǎn)。因此，針對(duì)糖蛋白基因序列與功能的研究對(duì)于揭示SVCV的免疫原性以及研制針對(duì)性的疫苗具有重要意義。研究表明，可通過(guò)pET-32a載體對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行原核誘導(dǎo)[15-16]，但G蛋白的表達(dá)量很低。本研究將截短后以及密碼子優(yōu)化后的G蛋白序列分段插入原核表達(dá)載體pET-32a中，旨在對(duì)SVCV糖蛋白序列進(jìn)行原核誘導(dǎo)優(yōu)化及免疫原性分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體及試劑 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α與E.coliBL21(DE3)以及原核表達(dá)載體pET-32a均由本實(shí)驗(yàn)室保存。pEGFP-G質(zhì)粒由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物水產(chǎn)病害試驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.1.2 試劑 dNTPs、Easy-Taq聚合酶、限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB公司；瓊脂糖、IPTGDNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，購(gòu)自O(shè)mega公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)購(gòu)自Thermo公司；考馬斯亮藍(lán)購(gòu)自上海雙螺旋生物科技有限公司，DNA maker與蛋白質(zhì)marker購(gòu)自北京全式金生物(TansGen Biotech)公司；抗鯉魚(yú)IgM單克隆抗體(Aquatic Diagnostics-Common/Koi carp IgM antibody-HRP conjugate)購(gòu)自廣州威佳科技有限公司

1.1.3 密碼子優(yōu)化的G序列合成 由于表達(dá)載體為細(xì)菌，據(jù)此對(duì)G基因片段進(jìn)行密碼子優(yōu)化，在金唯智(GENEWIZ)公司進(jìn)行基因片段合成，并在兩端設(shè)計(jì)引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。

1.2 方法

1.2.1 SVCV-G基因及截短后基因片段的克隆 以pEGFP-G質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果為模板，用Primer Premier 5.0軟件分別進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，目的即獲得pEGFP-G質(zhì)粒中G基因全長(zhǎng)序列及其截短后的基因片段。其中，G的上下游引物分別命名為G0F、G0R，截短后G片段的四對(duì)引物分別命名為G1F、G1R、G2F、G2R、G3F、G3R、G4F、G4R(表1，其中劃線部分分別為BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位點(diǎn)識(shí)別序列)。

表1 試驗(yàn)所需引物Table 1 Primers that needed in the experiment

根據(jù)表1中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：pEGFP-G質(zhì)粒1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，dNTPs 3.2 μL，10×Easy Taq Buffer(10×) 4 μL，Easy Taq聚合酶0.8 μL，Easy Pfu聚合酶0.3 μL，ddH2O 30.8 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)如下：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，52.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存10 min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用DNA凝膠回收試劑盒分別對(duì)5種目的條帶(G0, G1, G2, G3, G4)回收，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 表達(dá)載體pET-32a-GX的構(gòu)建與鑒定 將1.2.1中的5種PCR產(chǎn)物與pET-32a載體分別用BamHⅠ和XhoⅠ限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，回收目的片段后，將5種PCR產(chǎn)物分別與酶切后的pET-32a片段用T4連接酶于16 ℃連接10 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α，涂布于含0.1 mg/mL氨芐青霉素(Amp)的LB固體培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，分別挑取陽(yáng)性克隆菌株，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證和BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，將驗(yàn)證正確的菌株送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。將含SVCV G基因原序列的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pET-32a-G0；根據(jù)截短序列5'-3'的順序，將截短后的重組表達(dá)質(zhì)粒分別命名為pET-32a-G1，pET-32a-G2，pET-32a-G3，pET-32a-G4(圖1)。

圖1 pET-32a-GX載體的構(gòu)建Fig.1 Construction of the expression vector pET-32a-GX

1.2.3 表達(dá)載體pET-32a-Optimized G的構(gòu)建與鑒定 將含有密碼子優(yōu)化后G基因的片段與pET-32a載體分別用BamHⅠ和XhoⅠ限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，回收目的片段后，T4連接酶于16 ℃連接10 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α，涂布于含0.1 mg/mL氨芐青霉素(Amp)的LB固體培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，分別挑取陽(yáng)性克隆菌株，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證和BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的菌株送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定(圖2)。

1.2.4 重組表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá) 分別將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-32a-GX與pET-32a-OG轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL21(DE3)中，涂布于含0.1 mg/mL氨芐青霉素(Amp)的LB固體培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，隨機(jī)挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，將菌液送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

經(jīng)過(guò)初步誘導(dǎo)條件預(yù)試驗(yàn)后，確定最佳優(yōu)化條件。將空載體pET-32a以及測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆菌過(guò)夜培養(yǎng)至一定濃度后，按體積比1：50接種于含0.1 mg/mL氨芐青霉素(Amp)的10 mL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)至OD600為0.5～0.6時(shí)，加入IPTG使其終濃度為0.2 mmol/L，誘導(dǎo)3～4 h，收集菌液，將菌液于8 000 g/min離心5 min，棄上清后將沉淀用300 μL冰上預(yù)冷的PBS與7.5 μL PMSF重懸。于冰上用超聲波破碎儀處理樣品至澄清，12000 g/min 離心1 min，分離保存上清，將沉淀再次用300 μL冰上預(yù)冷的PBS與7.5 μL PMSF重懸后后保存樣品。

圖2 pET-32a-OG載體的構(gòu)建Fig.2 Construction of the expression vector pET-32a-OG

1.2.5 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳檢測(cè) 根據(jù)所表達(dá)蛋白的大小，配制 12 %分離膠和5 %濃縮膠。將1.2.4中獲得的上清液和重懸后的沉淀分別取30 μL，各加入6 μL SDS蛋白上樣緩沖液(6×)混合均勻后放于沸水浴中煮沸5 min，室溫冷卻后取20 μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R250染色6 h，再加入脫色液放置于搖床上進(jìn)行脫色4 h，期間多次更換脫色液，只蛋白條帶清晰可見(jiàn)后拍照保存。

1.2.6 誘導(dǎo)蛋白的Western blotting檢測(cè) 誘導(dǎo)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)后，將目的蛋白片段轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜并放置于含封閉液的平皿中，室溫脫色搖床封閉1 h；用含體積分?jǐn)?shù)為0.1 % Tween-20的PBST溶液清洗3次×10 min，加入經(jīng)TBST稀釋的一抗，室溫孵育4 h后，同樣用PBST溶液清洗3次×10 min后，加入抗鯉魚(yú)IgG-HRP，室溫孵育2 h；用PBST溶液清洗3次×10 min后進(jìn)行曝光步驟并拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 SVCV-G基因及截短后基因片段的克隆

通過(guò)PCR從pEGFP-G質(zhì)粒中獲得長(zhǎng)度為1092 bp的G0片段(圖3)與長(zhǎng)度分別為326 bp、315 bp、300 bp、303 bp的階段后的G1、G2、G3、G4片段(圖4)，采用BLAST將測(cè)序結(jié)果與模板序列對(duì)比后且檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致。

2.2 表達(dá)載體pET-32a-GX的構(gòu)建與鑒定

將純化后的PCR產(chǎn)物分別插入pET-32a載體中，并將重組質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，檢測(cè)結(jié)果顯示與預(yù)期基本一致(圖5)，采用BLAST將測(cè)序結(jié)果與模板序列對(duì)比后顯示插入序列與預(yù)期相同，證明成功構(gòu)建了5種表達(dá)載體pET-32a-GX。

2.3 表達(dá)載體pET-32a-OG的構(gòu)建與鑒定

將含有密碼子優(yōu)化后G基因插入pET-32a載體中，并將重組質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期片段大小一致，測(cè)序結(jié)果也顯示插入序列與預(yù)期相同，證明成功構(gòu)建了表達(dá)載體pET-32a-OG(圖6)。

圖3 擴(kuò)增產(chǎn)物G0的電泳圖譜 M. DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3 Electrophoregram of amplified product G0 M. DNA Maker；1. PCR product

圖4 擴(kuò)增產(chǎn)物G1、G2、G3、G4的電泳圖譜 M. DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-4. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.4 Electrophoregram of amplified product G1, G2, G3 and G4 M. DNA Maker；1-4. PCR product

2.4 重組表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳檢測(cè)

G蛋白的理論大小約為57 KD，且主要存在于沉淀包涵體中，重組表達(dá)菌株所表達(dá)的為截短后的G片段，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，結(jié)果表明，pET-32a-G3獲得的蛋白量最多，pET-32a-G2次之，而pET-32a-G1、pET-32a-G4、pET-32a-G0與pET-32a-OG誘導(dǎo)結(jié)果不明顯(圖7)。

圖5 重組表達(dá)載體pET-32a-GX的酶切產(chǎn)物電泳圖譜 M. DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-5. 重組表達(dá)載體 pET-32a-G1、pET-32a-G2、pET-32a-G3、pET-32a-G4、pET-32a-G0的BamH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切片段 Fig.5 Enzyme-digested product of recombinant expression vector pET-32a-GX M. DNA Maker；1-5. Plasmid pET-32a-G1, >pET-32a-G2, pET-32a-G3, pET-32a-G4, pET-32a-G0 digested by BamH Ⅰ and Xho Ⅰ

圖7 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)87083589 87088708 M. Blue Plus ⅠⅠ 蛋白Marker；1-7. 原核表達(dá)載體pET-32a-G1、pET-32a-G2、pET-32a-G3 、pET-32a-G4、pET-32a-OG、pET-32a-G0和pET-32a所表達(dá)的重組蛋白樣品；8. E. coli BL21(DE3) 空白菌株所誘導(dǎo)產(chǎn)物樣品Fig.7 SDS-PAGE result of expression of induced protein in E. coli BL21(DE3) M. Blue Plus ⅠⅠ Maker; 1-7. Recombinant protein of plasmid pET-32a-G1, pET-32a-G2, pET-32a-G3, pET-32a-G4, pET-32a-OG, pET-32a-G0 and pET-32a; 8. Sample of the products induced by blank strain of E. coli BL21(DE3)

2.5 誘導(dǎo)蛋白的Western blotting檢測(cè)

以本試驗(yàn)的誘導(dǎo)蛋白為抗原，以試驗(yàn)室已存鯉魚(yú)血清為陽(yáng)性血清作為一抗，以購(gòu)買(mǎi)的抗鯉魚(yú)IgM單克隆抗體作為二抗。通過(guò)Western blotting 檢測(cè)，表明截短表達(dá)的重組蛋白更容易表達(dá)(圖8)，且間接證明，截短表答的G與病毒的天然糖蛋白在免疫原性上的一致性。

圖8重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的Western blotting檢測(cè)1-4. 原核表達(dá)載體pET-32a-G1、pET-32a-G2、pET-32a-G3 、pET-32a-G4所表達(dá)的重組蛋白樣品
Fig.8 Western blotting result of expression of induced protein in E. coli BL21(DE3) 1-4. Recombinant protein of plasmid pET-32a-G1, pET-32a-G2,pET-32a-G3 and pET-32a-G4 inE.coliBL21(DE3), respectively

3 討 論

SVCV是嚴(yán)重影響世界多國(guó)漁業(yè)的主要病毒之一，給各國(guó)的鯉魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。2001-2004年，我國(guó)也曾開(kāi)展了SVCV的監(jiān)測(cè)工作，共分離鑒定了15個(gè)SVCV毒株，之后也陸續(xù)報(bào)道多篇有關(guān)SVCV的鑒定報(bào)道[17]。對(duì)于SVCV的檢測(cè)方法也逐漸被開(kāi)發(fā)，目前主要有間接免疫酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)[18]、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、套式RT-PCR[19]、熒光定量RT-PCR[20]、RT-LAMP[3]，SVCV糖蛋白是該病毒最主要的抗原，決定了病毒的血清學(xué)特征。SVCV工程菌表達(dá)的重組蛋白與SVCV毒株具有相同的免疫原性，但因SVCV完整的糖蛋白基因很難在體外獲得大量高效表達(dá)，因此可通過(guò)截短方式獲得重組載體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)[17,21-22]。張家林等[22]將位于N端和C端的影響重組蛋白表達(dá)的部分疏水性氨基酸序列去除，采用糖蛋白的21～463 aa區(qū)段部分插入pET-28a質(zhì)粒中進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)，并以體外誘導(dǎo)的蛋白作為免疫原制備了單克隆抗體。徐進(jìn)等[17]通過(guò)軟件對(duì)SVCV糖蛋白基因的親水性及抗原表位進(jìn)行分析后，將糖蛋白的29～467aa區(qū)段部分插入pGEX原核表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)體外誘導(dǎo)表達(dá)，且重組蛋白的免疫原性較好。通過(guò)體外誘導(dǎo)的原核蛋白能夠作為抗原為今后SVCV的免疫學(xué)診斷及相應(yīng)疫苗制備的研究奠定基礎(chǔ)，該試驗(yàn)也為今后的蛋白誘導(dǎo)工作提供了借鑒。

在進(jìn)行體外誘導(dǎo)的預(yù)試驗(yàn)時(shí)，含有全長(zhǎng)G蛋白基因的重組表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)量很低，可能的原因是全長(zhǎng)G含有較多的疏水性氨基酸及大腸桿菌中的稀有密碼子等影響了蛋白的表達(dá)。因此，本試驗(yàn)針對(duì)兩種潛在影響因素，通過(guò)分別設(shè)計(jì)不同引物擴(kuò)增截短片段以及進(jìn)行密碼子優(yōu)化兩種方式進(jìn)行再次誘導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)了G蛋白的高效表達(dá)。結(jié)果表明，在相同誘導(dǎo)條件下，重組表達(dá)載體pET-32a-G3與pET-32a-G2的表達(dá)量顯著高于其他重組載體，且免疫原性基本與pET-32a-G一致。該研究通過(guò)對(duì)SVCV糖蛋白基因的截短表達(dá)，證明截短后的基因片段仍能夠表達(dá)重組蛋白，且免疫原性較好，該研究為今后體外進(jìn)行的原核誘導(dǎo)表達(dá)蛋白提供參考。