楊健康 馮家祺 張平 曹光瓊 何黎 吳文娟

671000云南，大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（楊健康）；昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科（馮家祺、何黎、吳文娟），體檢中心（曹光瓊）；云南曲靖市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（張平）

痤瘡是一種常見的皮膚疾病，重型痤瘡是痤瘡中最嚴(yán)重的一類，它主要表現(xiàn)為廣泛分布的炎癥性皮損，經(jīng)常導(dǎo)致患者的心理問題[1?2]。遺傳因素在重型痤瘡的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[3]。全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）是一種發(fā)現(xiàn)疾病易感基因的有效方法[4?5]。針對中國人群重型痤瘡的GWAS研究曾發(fā)現(xiàn)2個新的易感基因[6]。但是，基因通常通過基因通路的形式在疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用[7]。因此，有必要進(jìn)行基因通路分析，研究基因通路與疾病的關(guān)系，從而為全基因組關(guān)聯(lián)研究提供有益補(bǔ)充。為了研究基因通路與重型痤瘡的關(guān)系，我們進(jìn)行重型痤瘡全基因組通路分析，希望提高對重型痤瘡發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識。

材料與方法

一、 數(shù)據(jù)

分析來源于重型痤瘡全基因組關(guān)聯(lián)研究的單核苷酸多態(tài)性（SNP）芯片數(shù)據(jù)[6]。采用美國Illumina公司HumanOmniZhongHua?8型芯片，于安徽醫(yī)科大學(xué)皮膚病學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室行芯片掃描。數(shù)據(jù)集包括1 056例重型痤瘡患者和1 056例健康對照的芯片數(shù)據(jù)，每個樣本檢測900 015個SNP位點(diǎn)。所有的重型痤瘡患者都經(jīng)皮膚科副主任或主任醫(yī)師診斷為4型（Pillsbury分級系統(tǒng)）：除顏面及胸背部泛發(fā)的粉刺、丘疹、膿皰外，皮損炎癥重，并有囊腫、結(jié)節(jié)和瘢痕。本研究經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者及健康對照均簽署知情同意書。標(biāo)本由昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、云南曲靖市第一人民醫(yī)院、安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院等全國三十余家醫(yī)院合作收集完成。

二、 方法

1.數(shù)據(jù)質(zhì)控：對原始的SNP芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，以去除不合格的樣本和SNP位點(diǎn)。首先對標(biāo)本進(jìn)行質(zhì)控，排除檢出率（call rates）＜98%的樣本，剩下合格的1 031份病例樣本和1 031份健康對照樣本。接著對SNP位點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)控，①排除所有樣本中檢出率＜98%的SNP位點(diǎn)；②排除所有樣本中最小等位基因頻率（MAF）＜0.01的SNP位點(diǎn)；③排除健康對照樣本中嚴(yán)重偏離哈迪-溫伯格平衡（P＜ 1× 10?4）的SNP位點(diǎn)。經(jīng)過質(zhì)控，共篩出合格的SNP位點(diǎn)809 305個。

2.SNP位點(diǎn)分析：使用Plink v1.90軟件[8]對SNP位點(diǎn)進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析。使用Q?Q圖評估群體分層的大小及對結(jié)果的影響。使用Haploview v4.2軟件做全基因組曼哈頓圖。

3.基因分析：使用VEGAS軟件計(jì)算[9]，采用蒙特卡羅（Monte Carlo）法統(tǒng)計(jì)基因與重型痤瘡的相關(guān)性，P值代表基因與重型痤瘡相關(guān)的顯著性水平。為了包括基因調(diào)控區(qū)的SNP位點(diǎn)，將基因的范圍定義為編碼序列（CDS）和20 kb的5′UTR及20 kb的3′UTR。接著將SNP定位到基因上。計(jì)算P值時，考慮了同一基因上所有SNP位點(diǎn)的影響，并且使用HapMap CHB和JPT的數(shù)據(jù)進(jìn)行連鎖不平衡校正。

4.通路分析：使用在線工具WebGestalt進(jìn)行基因通路分析[10]。該基因通路為KEGG數(shù)據(jù)庫定義的基因通路。為了減少通路大小對結(jié)果的影響，僅對包括10～200個基因的通路進(jìn)行分析。采用超幾何分布檢驗(yàn)計(jì)算每條通路的P值，使用錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）對得到的結(jié)果進(jìn)行多重檢驗(yàn)校正，校正后P＜0.05視為通路與重型痤瘡相關(guān)。

結(jié) 果

一、 SNP位點(diǎn)分析結(jié)果

40 920個SNP位點(diǎn)的P值小于0.05，見全基因組曼哈頓圖（圖1）。從圖2可以看出所有SNP位點(diǎn)對應(yīng)的P值整體上沒有偏離零假設(shè)分布，提示病例對照樣本匹配良好，人群分層因素對結(jié)果影響較小，與重型痤瘡顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)應(yīng)該是真實(shí)的相關(guān)信號。

二、 基因分析結(jié)果

所有基因中，919個對應(yīng)的P值小于0.05，其中12個P值小于0.001，見表1。

三、 通路分析結(jié)果

發(fā)現(xiàn)5條顯著的基因通路（P＜0.05），見表2。根據(jù)KEGG通路分類，可以將這5條通路分為代謝（1條）、內(nèi)分泌系統(tǒng)（1條）、癌癥（1條）、免疫系統(tǒng)（2條）。

圖1 全基因組關(guān)聯(lián)分析曼哈頓圖 不同的顏色分別代表23對染色體；縱坐標(biāo)為每個單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)的-log10（P）值，該值越大代表該位點(diǎn)的等位基因頻率在病例組與對照組間的差異越顯著

討 論

查詢PubMed數(shù)據(jù)庫和CNKI數(shù)據(jù)庫，截至2018年6月，未檢索到重型痤瘡全基因組通路研究的相關(guān)文獻(xiàn)，本研究可能是國際上第一個重型痤瘡的全基因組通路研究，將有利于加深我們對于重型痤瘡發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識。本研究發(fā)現(xiàn)的通路中有2個與免疫反應(yīng)和炎癥相關(guān)，分別是丙型肝炎和高親和力IgE受體信號通路。這和目前普遍認(rèn)為重型痤瘡是炎癥性疾病的認(rèn)識一致[11?12]。研究認(rèn)為，炎癥反應(yīng)會刺激毛囊皮脂腺導(dǎo)管角化過度，從而影響皮脂的正常排出[13]。

圖2 全基因組關(guān)聯(lián)分析Q-Q圖 橫坐標(biāo)為809 305個單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)-log10（P）值的期望值，縱坐標(biāo)為-log10（P）值的觀察值，圖中觀察值與期望值沒有偏離零假設(shè)分布，提示病例對照樣本匹配良好，人群分層因素對結(jié)果影響較小

表1 基因分析發(fā)現(xiàn)的12個與重型痤瘡關(guān)系最密切的基因

表2 通路分析方法發(fā)現(xiàn)的與重型痤瘡相關(guān)的5條基因通路

本研究發(fā)現(xiàn)一些新的基因通路可能與重型痤瘡相關(guān)，提示除了炎癥、免疫相關(guān)通路以外，其他通路可能也參與重型痤瘡的發(fā)生和發(fā)展。比如酪氨酸代謝通路，酪氨酸對于神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的合成也發(fā)揮重要作用[14]。多巴胺是可以使人產(chǎn)生快樂的神經(jīng)遞質(zhì)[15]。一項(xiàng)針對新加坡青少年進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，痤瘡的嚴(yán)重程度與精神壓力呈正相關(guān)[16]。因此，酪氨酸代謝可能對于重型痤瘡患者的精神壓力也有重要的影響[17]。催乳素信號通路和腎細(xì)胞癌通路與痤瘡的關(guān)系未見相關(guān)文獻(xiàn)報道，需要進(jìn)一步的功能研究來明確。

本次基因分析發(fā)現(xiàn)12個基因的P值小于0.001，其中包括重型痤瘡全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)的DDB2基因。DDB2基因編碼的蛋白是一個新發(fā)現(xiàn)的與雄激素受體有相互作用的蛋白，可能通過泛素化使雄激素受體蛋白被蛋白酶體降解[18]。其他基因如CLLU1OS、IL3與炎癥相關(guān)，IL3在激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞和介導(dǎo)T、B細(xì)胞增殖與分化及痤瘡的炎癥反應(yīng)中起重要作用[19]。

本研究結(jié)果只是針對中國人群重型痤瘡GWAS研究的全基因組通路分析，部分結(jié)果也可能存在假陽性的問題，有待新的重型痤瘡GWAS研究對這些結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。我們發(fā)現(xiàn)一些可能與重型痤瘡發(fā)病相關(guān)的基因通路，有望為后續(xù)的研究提供一些思路。