周乃慧 李艷 朱月倩 任孫 王淼淼 劉銘

215006蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科

已有研究證實(shí)，毛囊及毛囊周圍組織纖維化是導(dǎo)致雄激素性禿發(fā)中毛囊微型化的重要原因[1?2]。血管生成素是一種毛囊起源的血管生成因子，在體內(nèi)外均有促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)的作用，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)皮膚血管形成及促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞增殖有關(guān)[3?5]，而血管生成素是否能抑制雄激素性禿發(fā)區(qū)毛乳頭細(xì)胞中細(xì)胞外基質(zhì)成分如Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白的表達(dá)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究探討血管生成素對(duì)體外培養(yǎng)的雄激素性禿發(fā)區(qū)毛乳頭細(xì)胞中Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白表達(dá)的影響及其可能的作用機(jī)制。

材料與方法

一、 材料

1.組織來(lái)源：人頂部頭皮取自蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科門診因色素痣、皮脂腺痣或疣狀痣行手術(shù)切除的周圍正常頭皮組織，共10份?；颊吣挲g30～45歲，均為男性，符合雄激素性禿發(fā)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，禿發(fā)嚴(yán)重程度為Hamilton?Norwood 分級(jí)Ⅱ～Ⅲ級(jí)，且1年內(nèi)未用過(guò)影響毛發(fā)生長(zhǎng)的藥物，包括非那雄胺、米諾地爾溶液、生發(fā)中藥、降壓藥物及糖皮質(zhì)激素等。本研究通過(guò)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

2.主要試劑與儀器：血管生成素（美國(guó)R&D公司），L谷氨酰胺、分離酶、胰蛋白酶、膠原酶和胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），Dulbecco Modified Eagle Media（DMEM，美國(guó)Hyclone公司），總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]，CCK8試劑盒[東仁化學(xué)科技（上海）有限公司]，二氫睪酮（美國(guó)Sigma公司），兔抗人Ⅰ型膠原單克隆抗體、兔抗人纖維連接蛋白單克隆抗體、兔抗人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF?β1）單克隆抗體、兔抗人p?Smad2（磷酸化位點(diǎn)為S255）單克隆抗體、兔抗人p?Smad3（磷酸化位點(diǎn)為S423和S425）單克隆抗體、兔抗人β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（美國(guó)Abcam公司）。

二、 方法

1.人毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)：采用改良兩步酶消化法[7]分離人毛乳頭。分離得到的毛乳頭以DMEM（含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素）懸浮后接種于6孔培養(yǎng)板，待2～3周細(xì)胞大部分生長(zhǎng)融合后，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。

2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同傳代次數(shù)毛乳頭細(xì)胞中雄激素受體mRNA的表達(dá)：分別收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期第1～6代毛乳頭細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，雄激素受體正向引物 5′?ACAGGAGGAAGGAGAGGCTT?3′，反向引物5′?GTTGTTGTCGTGTCCAGCAC?3′，擴(kuò)增產(chǎn)物160 bp。β肌動(dòng)蛋白正向引物5′?GTCATTCCA AATATGAGATGCGTTG?3′，反向引物5′?GCTATCA CCTCCCCTGTGTG?3′，擴(kuò)增產(chǎn)物121 bp。PCR反應(yīng)體系：cDNA 1 μl，2 × SYBR Green Mix 10 μl，正向引物及反向引物各0.5 μl，DEPC水8 μl，總體積20 μl。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，在ABIPrism SDS軟件上查看基因的擴(kuò)增情況，導(dǎo)出閾值循環(huán)數(shù)（Ct）。以β肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參照，雄激素受體為目的基因，第1代毛乳頭細(xì)胞為對(duì)照組，以2?△△Ct計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，△Ct=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值，△△Ct=實(shí)驗(yàn)組△Ct-對(duì)照組△Ct。

3.CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖：取生長(zhǎng)融合的第1代毛乳頭細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后，以1.5×105/ml接種于96孔板，每孔100 μl，待細(xì)胞貼壁后換用無(wú)血清DMEM，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別加入0、10、20、40、80、160 μg/L血管生成素，每個(gè)濃度再分為2個(gè)亞組，分別加入0、0.1 nmol/L二氫睪酮，每組6個(gè)復(fù)孔。血管生成素及二氫睪酮按照產(chǎn)品說(shuō)明書儲(chǔ)存與操作，以維持其生物學(xué)活性的穩(wěn)定。培養(yǎng)48h后，按照CCK8試劑盒說(shuō)明，每孔加入CCK8試劑10 μl，繼續(xù)孵育3h，酶標(biāo)儀下測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光度（A450）。以A450代表細(xì)胞增殖活性。

4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western印跡檢測(cè)Ⅰ型膠原基因、纖維連接蛋白、TGF?β1 mRNA和蛋白以及p?Smad2和p?Smad3蛋白表達(dá)：取生長(zhǎng)融合的第1代毛乳頭細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后，以1.5×105/ml接種于6孔板，每孔2ml，待細(xì)胞貼壁后，換用無(wú)血清DMEM，實(shí)驗(yàn)分為3組，分別為不含二氫睪酮及血管生成素的對(duì)照組、0.1 nmol/L二氫睪酮組、0.1 nmol/L二氫睪酮+80 μg/L血管生成素組，每組3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48h后，①提取細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，Ⅰ型膠原基因正向引物：5′?GTGCTC GTGGAAATGATGGT?3′，反向引物：5′?CATTGGCAC CTTTAGCACCAG?3′，擴(kuò)增產(chǎn)物243 bp。纖維連接蛋白正向引物：5′?AGTACGGCCACCAAGAAG T?3′，反向引物：5′?ATCTCCCTCCTCACTCAGCT?3′，擴(kuò)增產(chǎn)物 227 bp。TGF?β1 正向引物：5′?GCAACAATTCCTGGCGATACC?3′，反向引物：5′?TAGTGAACCCGTTGATGTCC?3′，擴(kuò)增產(chǎn)物198bp；β肌動(dòng)蛋白引物序列、PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件見(jiàn)方法2；β肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參照，以2?△△Ct計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，△△Ct=實(shí)驗(yàn)組△Ct-對(duì)照組△Ct；②Western印跡檢測(cè)Ⅰ型膠原、纖維連接蛋白、TGF?β1、p?Smad2和p?Smad3蛋白的表達(dá)：收集細(xì)胞，RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，總蛋白40 μg上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉。加入一抗[兔抗人Ⅰ型膠原（1∶500）、纖維連接蛋白（1∶800）、TGF?β1蛋白（1∶1 000）、p?Smad2（1∶1 000）、p?Smad3（1∶500）、β 肌動(dòng)蛋白（1∶2 000）單克隆抗體]，4℃孵育過(guò)夜，二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體滴度1∶5 000）37℃孵育1h，洗膜、顯影，并用ImageJ對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，以目的蛋白與內(nèi)參β肌動(dòng)蛋白條帶的灰度比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

結(jié) 果

一、 雄激素受體mRNA在不同傳代次數(shù)毛乳頭細(xì)胞中的表達(dá)

第1～6代雄激素性禿發(fā)區(qū)毛乳頭細(xì)胞中，雄激素受體mRNA的表達(dá)水平（2-△△Ct）逐漸減少，分別為1.000± 0.000、0.675± 0.021、0.392± 0.042、0.045±0.003、0.021± 0.001、0.005± 0.000，各代間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1365.392，均P＜0.01），第6代毛乳頭細(xì)胞表達(dá)量?jī)H為第1代的1/200。

二、 血管生成素對(duì)雄激素性禿發(fā)區(qū)毛乳頭細(xì)胞增殖的影響

在不加二氫睪酮組，不同濃度血管生成素作用48h后，與對(duì)照組相比，20～160 μg/L血管生成素能明顯促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞增殖（均P＜0.05），其中以80 μg/L血管生成素促進(jìn)增殖作用最為顯著（P＜0.05）。在同一濃度血管生成素作用下，含二氫睪酮組毛乳頭細(xì)胞增殖均明顯低于不含二氫睪酮組（均P＜0.05）。在二氫睪酮作用下，與對(duì)照組相比，20～160 μg/L血管生成素能夠促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞增殖（均P＜ 0.05），其中以80、160 μg/L血管生成素促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞增殖的作用最為顯著（均P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度血管生成素作用48h后毛乳頭細(xì)胞增殖活性比較（A450，±s）

表1 不同濃度血管生成素作用48h后毛乳頭細(xì)胞增殖活性比較（A450，±s）

注：n=6。a～e分別示與同一亞組對(duì)照組、10～80 μg/L血管生成素組相比，P＜0.05

血管生成素0（對(duì)照組）10 μg/L 20 μg/L 40 μg/L 80 μg/L 160 μg/L F值P值二氫睪酮0 0.263±0.004 0.266±0.004 0.275±0.003a b 0.295±0.003a b c 0.334±0.003a b c d 0.328±0.004a b c d e 476.309＜0.01 t值0.1 nmol/L 0.186±0.003 0.188±0.004 0.194±0.002a b 0.245±0.004a b c 0.284±0.003a b c d 0.286±0.002a b c d 1 478.716＜0.01 39.384 36.008 52.379 24.495 29.084 22.207 P值＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

三、 血管生成素對(duì)雄激素性禿發(fā)區(qū)毛乳頭細(xì)胞Ⅰ型膠原基因、纖維連接蛋白和TGF?β1 mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，二氫睪酮能夠顯著上調(diào)毛乳頭細(xì)胞中Ⅰ型膠原基因、纖維連接蛋白和TGF?β1 mRNA的表達(dá)（均P＜0.05）。與二氫睪酮組相比，二氫睪酮+血管生成素組Ⅰ型膠原基因、纖維連接蛋白和TGF?β1 mRNA的表達(dá)明顯減少（均P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 血管生成素對(duì)雄激素性禿發(fā)區(qū)毛乳頭細(xì)胞中Ⅰ型膠原基因、纖維連接蛋白及TGF?β1 mRNA（2?△△Ct）相對(duì)表達(dá)水平的影響（±s）

表2 血管生成素對(duì)雄激素性禿發(fā)區(qū)毛乳頭細(xì)胞中Ⅰ型膠原基因、纖維連接蛋白及TGF?β1 mRNA（2?△△Ct）相對(duì)表達(dá)水平的影響（±s）

注：n=3。a與對(duì)照組相比，P＜0.05；b與二氫睪酮組相比，P＜0.05。TGF?β1：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1

組別對(duì)照組二氫睪酮組二氫睪酮+血管生成素組F值P值Ⅰ型膠原基因1.000±0.000 4.329±0.165a 1.563±0.143a b 597.669＜0.01纖維連接蛋白1.000±0.000 2.156±0.115a 1.290±0.063a b 187.907＜0.01 TGF?β1 1.000±0.000 1.707±0.100a 1.136±0.098b 64.259＜0.01

四、 血管生成素對(duì)雄激素性禿發(fā)區(qū)毛乳頭細(xì)胞Ⅰ型膠原、纖維連接蛋白、TGF?β1、p?Smad2及p?Smad3蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，二氫睪酮能夠顯著上調(diào)毛乳頭細(xì)胞中Ⅰ型膠原、纖維連接蛋白、TGF?β1、p?Smad2及p?Smad3蛋白的表達(dá)（均P＜0.05）。與二氫睪酮組相比，二氫睪酮+血管生成素組Ⅰ型膠原、纖維連接蛋白、TGF?β1、p?Smad2及p?Smad3蛋白的表達(dá)均減少（均P＜0.05）。見(jiàn)圖1、表3。

圖1 Western印跡檢測(cè)血管生成素對(duì)雄激素性禿發(fā)區(qū)毛乳頭細(xì)胞Ⅰ型膠原、纖維連接蛋白等蛋白表達(dá)的影響 1：對(duì)照組；2：二氫睪酮組；3：二氫睪酮+血管生成素組

表3 血管生成素對(duì)雄激素性禿發(fā)區(qū)毛乳頭細(xì)胞Ⅰ型膠原、纖維連接蛋白、TGF?β1等蛋白表達(dá)的影響（±s）

表3 血管生成素對(duì)雄激素性禿發(fā)區(qū)毛乳頭細(xì)胞Ⅰ型膠原、纖維連接蛋白、TGF?β1等蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：n=3。以目的蛋白與β肌動(dòng)蛋白條帶的灰度比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。a與對(duì)照組相比，P＜0.05；b與二氫睪酮組相比，P＜0.05。TGF?β1：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1

組別對(duì)照組二氫睪酮組二氫睪酮+血管生成素組F值P值Ⅰ型膠原0.188±0.005 0.416±0.014a 0.184±0.006b 588.536＜0.01纖維連接蛋白0.092±0.001 0.151±0.004a 0.096±0.003b 271.000＜0.01 TGF?β1 0.177±0.003 0.314±0.011a 0.177±0.005b 385.609＜0.01 p?Smad2 0.108±0.006 0.238±0.003a 0.116±0.001b 1 026.987＜0.01 p?Smad3 0.119±0.005 0.227±0.002a 0.099±0.003a b 1 260.542＜0.01

討 論

在雄激素性禿發(fā)的實(shí)驗(yàn)研究中，一直缺乏理想的動(dòng)物模型和生物學(xué)性狀穩(wěn)定的毛乳頭細(xì)胞株[8]。我們利用外科手術(shù)后雄激素性禿發(fā)區(qū)的頭皮組織，成功分離與培養(yǎng)了原代毛乳頭細(xì)胞。由于二氫睪酮需與毛乳頭細(xì)胞的雄激素受體結(jié)合后才能發(fā)揮生物學(xué)活性，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的雄激素性禿發(fā)區(qū)的毛乳頭細(xì)胞隨著傳代次數(shù)的增加，雄激素受體mRNA的表達(dá)量明顯降低，至第6代其表達(dá)量?jī)H為第1代的1/200，這與既往文獻(xiàn)報(bào)道相似[9]。為克服毛乳頭細(xì)胞傳代次數(shù)增加后雄激素受體低表達(dá)對(duì)體外實(shí)驗(yàn)的影響，本研究選擇第1代融合生長(zhǎng)的毛乳頭細(xì)胞傳代后用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，0.1 nmol/L二氫睪酮能夠明顯抑制雄激素性禿發(fā)區(qū)毛乳頭細(xì)胞增殖，20～160 μg/L血管生成素則能明顯拮抗二氫睪酮抑制毛乳頭細(xì)胞增殖的作用，其中以80和160 μg/L血管生成素的作用最為明顯。

毛囊及毛囊周圍組織的纖維化與雄激素性禿發(fā)的發(fā)病及嚴(yán)重程度密切相關(guān)，其中Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白是介導(dǎo)毛囊及毛囊周圍組織纖維化的兩種主要細(xì)胞外基質(zhì)成分[10?12]。本研究中實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western印跡結(jié)果顯示，0.1 nmol/L二氫睪酮能夠明顯促進(jìn)雄激素性禿發(fā)區(qū)毛乳頭細(xì)胞中Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白mRNA及蛋白的表達(dá)，80 μg/L血管生成素則能夠明顯拮抗由二氫睪酮誘導(dǎo)的Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白mRNA及蛋白的表達(dá)。目前認(rèn)為，TGF?β1是調(diào)控雄激素性禿發(fā)中毛囊及毛囊周圍組織纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，二氫睪酮作用于毛乳頭細(xì)胞后，誘導(dǎo)TGF?β1表達(dá)增加，TGF?β1與其受體結(jié)合后形成TGF?β1/TGF?βRⅠ/TGF?βRⅡ復(fù)合物，進(jìn)一步磷酸化Smad2和Smad3，活化TGF?β1/Smad信號(hào)通路，最終引起與纖維化相關(guān)的目的基因包括Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白等的轉(zhuǎn)錄[12?15]。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，0.1 nmol/L二氫睪酮能夠明顯促進(jìn)雄激素性禿發(fā)區(qū)毛乳頭細(xì)胞中TGF?β1 mRNA和蛋白表達(dá)，同時(shí)加入80 μg/L血管生成素作用后，TGF?β1 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低，且p?Smad2和p?Smad3蛋白表達(dá)亦明顯減少。

綜上所述，血管生成素在體外能抑制雄激素性禿發(fā)區(qū)毛乳頭細(xì)胞中細(xì)胞外基質(zhì)成分Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白的表達(dá)，其機(jī)制可能與下調(diào)TGF?β1表達(dá)及抑制TGF?β1/Smad信號(hào)通路的活化有關(guān)。由于毛囊及毛囊周圍組織纖維化對(duì)雄激素性禿發(fā)的發(fā)生與發(fā)展起重要作用，如果以血管生成素為靶分子，篩選能夠上調(diào)血管生成素表達(dá)的外用藥物，抑制或延緩纖維化的過(guò)程，將有望為臨床上治療雄激素性禿發(fā)提供新的思路。