張翔宇 鄺良德 李叢艷 張翠霞 鄭潔 楊超 任永軍 郭志強 唐麗 鄧曉東 雷岷 黃鄧萍 謝曉紅

摘要：miRNA是一類長度約22 bp的小分子非編碼RNA，在骨骼肌生長和肌細胞分化過程中起著重要的調控作用。利用Solexa測序技術對3只84日齡成年公兔的腿肌進行了miRNA測序，旨在評估高通量測序在發(fā)掘家兔miRNA中的數(shù)據(jù)質量以及解析家兔肌肉組織中miRNA的生物學特征。結果表明，除前4位堿基的錯誤率略高于0.5%外，其他位置的堿基錯誤率均低于0.5%，說明測序質量好、可信度高，獲得的序列可用于后續(xù)miRNA的鑒定分析。純凈序列中其他類型RNA的比例僅占2.07%。肉兔肌肉中18～24 nt的小RNA首位堿基以U為主，其次為堿基A，具有很強的偏向性。miRNA序列長度主要分布在20～24 nt范圍內，占純凈序列的90%以上。miRNA長度分布的不平衡和首位堿基的偏向性可能與miRNA的作用機理和具體生物學功能有關。

關鍵詞：家兔；肌肉；高通量測序；miRNA

中圖分類號：S829.1 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）16-0097-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.16.023 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Solexa Sequencing and Bioinformatics Analysis on miRNA from Rabbit Muscle

ZHANG Xiang-yu，KUANG Liang-de，LI Cong-yan，ZHANG Cui-xia，ZHENG Jie，YANG Chao，REN Yong-jun，

GUO Zhi-qiang，TANG Li，DENG Xiao-dong，LEI Min，HUANG Deng-ping，XIE Xiao-hong

（Sichuan Animal Science Academy/Key Laboratory of Animal Genetics and Breeding in Sichuan Province，Chengdu 610066， China）

Abstract： miRNA as a kind of micromolecule non-coding RNA with the length of about 22 bp plays an important regulatory role in skeletal muscle growth and muscle cell differentiation. This research uses Solexa sequencing technology to conduct miRNA sequencing on three eight-four-day-old adult male rabbits， aiming at evaluating the quality of high-throughput sequencing in meat-rabbit miRNA data mining， and exploring the biological characteristics of miRNA in meat-rabbit muscular tissues. Results show that， except for bases in first three positions with an error rate slightly higher than 0.5%， bases in other positions have an error rate of lower than 0.5%， which indicates good sequencing quality， high reliability， and the applicability of obtained sequence in subsequent miRNA identification and analysis. Other types of RNA in pure sequences only take up 2.07%. The 18～24 nt small RNA first base in meat-rabbit muscle is mainly U base， and A base for the second with strong directivity. miRNA sequence length is mainly within the range of 20～24 nt， which takes up more than 90% of pure sequences. miRNA sequence length imbalance and the directivity of first-place base may be related to the action mechanism and specific functions of miRNA.

Key words： rabbit； muscle； high throughput sequencing； miRNA

家兔是節(jié)糧型食草小家畜，也是重要的人類肉食來源之一，還是許多人類疾病研究的理想動物模型。過去30年間，世界各國對家兔生長速度和肉質的遺傳改良，已獲得較大研究進展。歐洲的兔業(yè)發(fā)達國家已選育出齊卡（ZIKA）、伊拉（HYLA）和伊普呂（ELCO）等具有優(yōu)良生長性能和肉用性能的肉兔配套系[1]。隨著經(jīng)濟的發(fā)展和消費觀念的改變，如何進一步提高兔肉產(chǎn)量和品質成為各國肉兔育種公司共同關注的焦點問題。對家兔肌肉生長發(fā)育機制認識的不足，尤其是對重要的調控因子及其作用機理知之甚少，極大地限制了家兔產(chǎn)肉性能的進一步提高。研究表明，miRNA作為一類新的肌肉調控因子在肌肉的生長發(fā)育中起著重要的調節(jié)作用[2，3]。miRNA幾乎參與了肌肉細胞增殖和分化的所有過程，通過對各個時期關鍵因子的靶向作用，調控骨骼肌的發(fā)育[4]。高通量測序技術能夠發(fā)掘和鑒定某一物種轉錄組水平的miRNA，具有檢測速度快、成本低、覆蓋深度廣、信息量大的特點，是發(fā)掘和鑒定miRNA的有效工具[5]。與重點研究某一個或某一類轉錄子的傳統(tǒng)方法相比，高通量測序技術能夠從全基因組水平揭示轉錄組。目前利用該技術已經(jīng)對家蠶[6]、雞[7]、血吸蟲[8]、果蠅[9]和線蟲[10]等不同物種的miRNA進行了成功的發(fā)掘。與其他家畜相比，家兔miRNA的研究極為有限，而利用高通量測序技術進行家兔肌肉中miRNA鑒定的研究還未見報道，這將極大地限制全面、深入地理解miRNA在家兔肌肉生長發(fā)育過程中的作用。同時，也對高通量測序技術在家兔肌肉中miRNA的檢測效果的評價提出了挑戰(zhàn)。本研究利用Solexa高通量測序平臺對新西蘭白兔肌肉中的miRNA進行了系統(tǒng)地鑒定，旨在為高通量測序技術在家兔肌肉中檢測miRNA的效果和效率評估提供可靠數(shù)據(jù)，也為深入揭示miRNA在家兔肌肉發(fā)育過程中的作用機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗兔飼養(yǎng)于四川省畜牧科學研究院種兔場，選取同一天出生并在同一飼養(yǎng)管理條件下生長的84日齡新西蘭白兔3只（公兔）。屠宰后迅速采集腿肌，裝入無RNasee的離心管中，立即放入液氮中進行保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取 采用TRIZOL R Reagent（Invitrogen，San Diego，CA，USA）試劑盒進行總RNA的提取，具體步驟參照試劑盒的操作指南。取1 μL總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳（1%）檢測，在180 V的電壓下電泳5 min，初步判斷樣品是否降解或污染，并簡單鑒定RNA的完整性。檢測合格的肌肉RNA樣品送至北京諾禾致源科技有限公司進行測序。

1.2.2 Small RNA文庫的制備與測序 每個樣品取3 μg總RNA按照Illumina Tru SeqTM RNA Sample Preparation Kit（Illumina，San Diego，USA）的操作說明選取不同的index標簽建庫。文庫質量達到要求后，使用Tru Seq PE Cluster Kit v3-c Bot-HS（Illumina）試劑在cBot上生成簇。然后在Hiseq 2000測序平臺上進行單末端測序，得到50 bp的單端測序reads。

1.3 測序數(shù)據(jù)的質量控制

測序得到的原始序列（raw reads）以fastq格式保存，為了提高測序的質量，需要對原始序列去除其中的低質量reads、有接頭污染reads或沒有插入片段的reads、包含poly A/T/G/C的reads，最后獲得到過濾后干凈的序列（clean reads）。篩選一定長度區(qū)間范圍內的clean reads進行長度分布統(tǒng)計。

1.4 sRNA分類注釋統(tǒng)計

對所有small RNA與各類RNA進行比對以實現(xiàn)對其進行分類注釋?？紤]到存在一個sRNA可能同時比對上幾種不同的注釋信息的情況，為了使每個unique sRNA有惟一的注釋，按照已知miRNA>rRNA>tRNA>snRNA>snoRNA>repeat>gene>novel miRNA的優(yōu)先級順序將small RNA進行比對注釋。

2 結果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)質量

對不同位置的測序錯誤率分布進行檢測。結果（圖1）表明，除前4位堿基的錯誤率接近0.5%外，其他位置的堿基錯誤率均低于0.5%，表明測序質量較高。

2.2 長度分布

哺乳動物miRNA的長度區(qū)間一般位于18～30個核苷酸間。對本研究中3個小RNA文庫的純凈序列進行核苷酸長度統(tǒng)計，分析了樣品中的miRNA長度分布，結果如圖2所示。miRNA序列長度主要分布在20～24 nt范圍內，占純凈序列的90%以上。其中，長度為22 nt的miRNA分布最多，占到了純凈序列的60%左右，其次為23 nt，再次為21 nt。

2.3 首位堿基偏向性

由圖3可知，首位堿基的分布在不同長度miRNA中有很強的偏向性。肌肉中18～24 nt的小RNA首位堿基以U為主，其次為堿基A，而G與C在miRNA中所占的比例相對最小。其中長度為20、22、23、24位的首位堿基為 U的小RNA所占比例較高，均在90%以上。

2.4 miRNA的分類注釋

測序樣品的質量可以通過其他RNA類型所占比列進行評價。測序結果中其他類型RNA的比例僅占2.07%（表1）。重復序列在被剔除的RNA類型中占的比重最大，達到被剔除總量的43.48%。而來自外顯子的序列比例占0.51%，表明mRNA的降解程度低，構建的miRNA文庫質量高，測序樣本可信度高。miRNA經(jīng)注釋后，67%的序列被注釋為已知miRNA，不難看出測序所獲得的序列主要是miRNA。

3 討論

高通量測序技術具有覆蓋度深和性價比高的特點，能避免生物信息學方法在miRNA發(fā)掘上過度依賴物種全基因組信息和cDNA克隆受高表達RNA干擾的問題，對鑒定和發(fā)掘不同發(fā)育階段和生理狀態(tài)下生物體的miRNA起到了極大的推動作用[11]。目前利用該技術已經(jīng)對靈長類哺乳動物的miRNA進行了成功的發(fā)掘[12，13]。本研究構建了3個新西蘭公兔的miRNA文庫，利用Illumina公司的Solexa技術進行序列測定，產(chǎn)生了10 512 981條純凈序列。對Illumina高通量測序平臺而言，測序錯誤率會隨著測序序列長度的增加而升高，同時，建庫過程中反轉錄需要隨機引物導致前幾個堿基的測序錯誤率也會增加[14，15]。但從其他位點的錯誤率和其他RNA類型所占比列來看，高通量測序同樣適合肉兔肌肉組織中的miRNA的系統(tǒng)發(fā)掘。

張曉東等[16]利用Solexa平臺對山羊卵巢組織中的miRNA進行了系統(tǒng)的發(fā)掘和鑒定，對長度分析后發(fā)現(xiàn)，miRNA長度主要分布在22 nt，占到了50%以上，其次是長度為23 nt的miRNA，達到了20%。熊顯榮等[17]利用高通量測序技術對牦牛卵巢的小RNA進行了測序，長度為22 nt的miRNA序列居多，達到了50%，其次是長度為23 nt的miRNA，達到了20%。凌英會等[18]利用Solexa平臺對綿羊肌肉組織中的miRNA進行了測序和分析，發(fā)現(xiàn)肌肉中小RNA的長度一半左右為22 nt，20%左右為23 nt。本研究中長度為22 nt的小RNA占到了1/2，23 nt的小RNA達到17%以上。不同畜種和不同組織器官間小RNA的分布差異不大，表明這些miRNA在作用機制上基本一致。但植物上的研究結果與動物的結果卻存在較大的差異。黃儒等[19]采用HiSeq深度測序技術對低溫脅迫下的東農(nóng)冬小麥進行小RNA鑒定，分析后發(fā)現(xiàn)長度為24 nt的小RNA為主要類型，占總量的40%以上，其次是長度為21 nt的小RNA，達到了20%左右，可能植物和動物的小RNA在作用方式上存在較大的差異。另外，21 nt可能是mRNA 表達所需的最小熱力學穩(wěn)定長度的要求。與經(jīng)典的轉錄翻譯途徑相比，將70 nt 左右的前體剪切為21 nt左右的成熟miRNA要簡單快速得多，可以實現(xiàn)對基因表達的快速調控，加強生物體對環(huán)境刺激的反應[20]。葉茂等[21]認為大約21 nt的排列組合產(chǎn)生的miRNA，可以滿足其所要調控的基因數(shù)量，而不會造成浪費，并且轉錄的長度越短，轉錄出錯率也就越小，這對調控過程可能更為有效。

首位堿基偏向性研究均發(fā)現(xiàn)不同組織中鑒定的miRNA均具有U和A堿基偏向性。張方等[22]利用Solexa測序技術對腎周（PEF）、皮下（SUF）和尾部（TAF）脂肪進行了測序，發(fā)現(xiàn)PEF和SUF文庫中首位堿基偏向U，所占比例均為95%左右，其次為堿基A、G和C含量。胡俊杰等[23]利用高通量技術對甘肅高山細毛羊性成熟期卵巢的miRNA進行了鑒定，結果表明，卵巢上的19、20、22、24 nt的小RNA首位堿基以U為主，21、25和26 nt的小RNA首位堿基以A為主，同時卵巢上的RNA長度主要分布在22和21 nt上。首位堿基的偏向性不僅與miRNA的成熟過程有關，可能還與靶基因的結合，以及對靶基因的表達調控有關。核苷酸序列的物理或生物學特性會受其堿基組成的影響。首位堿基為U使得miRNA更容易被AGO蛋白識別。分析miRNA首位堿基有助于評價測序質量和了解miRNA的生物學功能。

4 結論

本研究利用Solexa測序技術對3只84日齡新西蘭公兔的腿肌進行了miRNA測序，獲得了質量好、可信度高的序列，該技術適合家兔肌肉中miRNA的發(fā)掘。miRNA長度以22 nt為主，首位堿基以U為主，其次為堿基A，可以對長度分布的不平衡性和首位堿基的偏向性與miRNA的作用機理展開進一步的研究。

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