王重重 彭輝

摘要：人工授精技術(shù)的應(yīng)用極大促進(jìn)了現(xiàn)代畜牧業(yè)的發(fā)展，而精液保存是制約人工授精技術(shù)廣泛應(yīng)用的重要一環(huán)。雖然對兔精液保存的研究較早，但是進(jìn)展仍然緩慢。作者主要對兔精液的保存原理、保存方法以及影響兔精液保存的相關(guān)因素進(jìn)行了綜述，以期為探究出更好的兔精液保存方法以及人工授精技術(shù)在商品兔生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞：兔精液；保存方法；保存原理；影響因素

中圖分類號(hào)：S858.291 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2018）16-0005-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.16.001 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Research Progress on Rabbit Semen Preservation

WANG Chong-chong，PENG Hui

（College of Animal Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，China）

Abstract： The application of artificial insemination tremendously accelerates the development of modern animal husbandry，while semen preservation is an important part restricting the extensive application of artificial insemination technology. Although the study of rabbit semen preservation has been carried out early， the progress is still slow. The authors mainly reviewed the preservation methods， preservation principles and related factors affecting the semen preservation of rabbit semen， in order to provide a reference for exploring better rabbit semen preservation methods and the application of artificial insemination technology in the production of commercial rabbits.

Key words： rabbit semen； preservative methods； preservative principles； influencing factors

目前，中國養(yǎng)兔產(chǎn)業(yè)的規(guī)模不斷擴(kuò)大，培育高品質(zhì)和高繁殖率的種公兔群對于兔產(chǎn)業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要。伴隨著兔產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，人工授精技術(shù)在商品兔生產(chǎn)中越來越重要[1]。雖然人工授精技術(shù)在家畜繁殖上的應(yīng)用比較成熟，但是在兔生產(chǎn)中的應(yīng)用還存在一定的問題，其中兔精液保存就是影響兔生產(chǎn)人工授精技術(shù)推廣的一個(gè)非常重要的因素[2，3]。兔精液的保存主要分為常溫保存、低溫保存和冷凍保存三個(gè)方面。精液常溫保存時(shí)，由于精子自身的新陳代謝旺盛，能量消耗快，只能保存較短的時(shí)間。兔精液在低溫狀態(tài)下可以保存一周左右，因此，對于優(yōu)良的種公兔精液若想長期保存或者跨季保存，低溫保存則無法完成。冷凍保存可以使精液長期或者跨季節(jié)保存，但是對精子的損傷也較大，精液解凍后，精子活率較低，并且冷凍保存也需要較高的投入[4]。因此，精液冷凍保存技術(shù)在兔生產(chǎn)中的應(yīng)用相對受限。為此，研究人員對該技術(shù)的研究在不斷深入，以期實(shí)現(xiàn)精液冷凍保存技術(shù)在兔生產(chǎn)中的應(yīng)用[5]。本研究主要對兔精液的保存方法、保存原理以及影響兔精液保存的相關(guān)因素進(jìn)行綜述，以期為探究出更好的兔精液保存方法以及人工授精技術(shù)在商品兔生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用提供參考。

1 兔精液的保存原理與方法

1.1 兔精液保存原理

精液常溫保存的原理：精液稀釋液中加入一些酸性物質(zhì)或充入CO2，進(jìn)而控制精液的pH，使精子處在酸性環(huán)境中。精子在酸性環(huán)境下的活動(dòng)受到抑制、能量消耗降低，其處于可逆的靜止?fàn)顟B(tài)，且可保持受精能力。

精液低溫保存的原理：在低溫環(huán)境下精子處于休眠狀態(tài)，其代謝機(jī)能和運(yùn)動(dòng)能力都大大減弱。在此條件下精子所消耗的能量減少，仍然保持著受精能力，升溫后便可恢復(fù)。

精液冷凍保存的原理：在超低溫條件下，精子代謝機(jī)能幾乎停止，運(yùn)動(dòng)也停止，其活性以相對靜止的方式保留下來。當(dāng)溫度回升后，精子代謝機(jī)能、運(yùn)動(dòng)能力以及受精能力又會(huì)恢復(fù)起來[6，7]。

人工采集的精液并不能在自然條件下長期保存，需要經(jīng)過進(jìn)一步的處理才能延長保存時(shí)間。在商品兔生產(chǎn)中，可以根據(jù)實(shí)際需求選擇使用不同的保存方法。

1.2 兔精液的液態(tài)保存

兔精液的液態(tài)保存可分為常溫保存和低溫保存。常溫條件下保存時(shí)，一般是將精液稀釋后分裝并密封，用紗布包好在15～20 ℃的環(huán)境下避光保存，其保存時(shí)間不長，一般保存1～2 d。低溫保存時(shí)，保存溫度一般是0～5 ℃，精液稀釋后通過緩慢降溫的方法將溫度降到0～5 ℃，并用紗布包裹放入低溫環(huán)境中，可以保存一個(gè)星期左右[8]。

兔精液的液態(tài)保存方法具體如下：將采集的精液用4層紗布過濾，為消除種兔間個(gè)體差異，將目測品質(zhì)正常的精液進(jìn)行混合，然后利用顯微鏡進(jìn)行精子活力和密度的檢測。檢測完成后，使用商業(yè)化的兔精液稀釋液或者使用自行配制的稀釋液，并在30 ℃左右溫度下平衡30～60 min后待用。精液稀釋時(shí)，將精液與稀釋液置于同一溫度下，以1∶50～1∶15的比例稀釋精液。精液稀釋完成后還需要再次檢測精子活力，要求鏡檢精子活力在0.6以上[9，10]，之后將符合要求的兔精液進(jìn)行分裝保存。兔精液低溫保存時(shí)，還需要在稀釋液中加入卵黃或奶類等抗凍物質(zhì)，以防止精子發(fā)生冷休克。

1.3 兔精液的冷凍保存

兔精液的冷凍保存即超低溫保存，是將采集的兔新鮮精液進(jìn)行特殊處理，使用干冰（-79 ℃）或液氮（-196 ℃）等作為冷凍源，將精液保存在超低溫的環(huán)境下，進(jìn)而達(dá)到長期保存的目的[6]。兔精液冷凍保存的具體操作如下。

1.3.1 精液稀釋以及降溫平衡 目前，在精液稀釋時(shí)多采用兩步稀釋法，即在降溫平衡之后再加入滲透性冷凍保護(hù)劑，避免冷凍對精液產(chǎn)生較大的毒害作用。由于冷凍保護(hù)劑加入不久就要進(jìn)行下一步冷凍，因此，兩步稀釋法會(huì)增加操作難度。此外，冷凍保護(hù)劑的保護(hù)效果可能會(huì)因保護(hù)劑未完全滲透而下降，需要對滲透性冷凍保護(hù)劑進(jìn)行提前降溫，注意此過程操作要迅速，避免精子在第二次的稀釋過程中死亡[4]。兔精液采集后盡量在短時(shí)間內(nèi)完成相關(guān)操作，在鮮精經(jīng)過品質(zhì)檢查后，把活率高于0.8的用于冷凍保存[11]。操作上將精液加入到離心管中，將配好的稀釋液從水浴鍋（37 ℃）中取出，按一定稀釋比例將稀釋液加入到離心管中，混合均勻后用封口膜封口并編號(hào)，然后用紗布包裹若干層[4]。精液在冷凍保存之前需要進(jìn)行降溫平衡處理，即將精液稀釋后經(jīng)緩慢降溫至4～5 ℃，并在該溫度下放置一段時(shí)間，使精子的耐凍性得以增強(qiáng)，這個(gè)處理過程叫做降溫平衡[4]；一般將兔稀釋精液在2 h內(nèi)逐漸冷卻至4 ℃，并在此溫度下平衡30 min左右[12]。

1.3.2 熏蒸和冷凍 熏蒸是指精液在放入液氮罐中冷凍保存之前先用液氮?dú)怏w進(jìn)行熏蒸，其目的是保證精液以玻璃態(tài)進(jìn)行冷凍，減少精子因冰晶化而導(dǎo)致的死亡。首先取一密閉可開口的容器（如泡沫箱），檢測其密閉性并確認(rèn)其不漏液，將液氮從液氮罐中倒入泡沫箱。之后將平衡后的精液從4 ℃恒溫箱中取出，充分搖勻，放在紗布上；用細(xì)管吸取相對應(yīng)離心管中的精液，并用燒熱的鑷子在恒溫箱中進(jìn)行細(xì)管封口。若無恒溫操作箱，細(xì)管封口過程可在墊3～4層紗布的冰上操作[4]。封管過程要迅速，以減小或避免溫度回升造成的精子死亡。封管后將細(xì)管放在液氮上方熏蒸10 min，熏蒸結(jié)束后，將細(xì)管分裝在紗布袋中并投入液氮里，之后轉(zhuǎn)移至液氮罐中冷凍保存。精液解凍時(shí)，可將液氮罐中的細(xì)管取出，迅速投入37 ℃水浴鍋中解凍30 s，待細(xì)管顏色變黃后取出則可[13]。

2 影響兔精液保存的因素

2.1 影響精液液態(tài)保存的因素

2.1.1 pH 在液態(tài)精液的保存過程中，由于精子代謝機(jī)能仍然存在，尤其在常溫保存的條件下代謝很強(qiáng)，且能量消耗較快，伴隨著代謝產(chǎn)物的積累，精液的pH也會(huì)發(fā)生變化[1]。由于pH的變化致使一些酶活性受到抑制，進(jìn)而影響精子的受精能力。因此，保持精子所處環(huán)境的pH在一定范圍是必要的。一般正常精液的pH在6.59～7.50，精液液態(tài)保存時(shí)要與正常精液的pH相等或偏低方可[10]。

2.1.2 溫度 精液液態(tài)保存時(shí)，其基本條件就是依據(jù)精液相應(yīng)的生理特性，提供精子在體外生存的適宜環(huán)境，而精子的保存溫度是影響精子能否存活的重要環(huán)境因素[10]。低溫保存在一定程度上使精子代謝變慢，能量消耗減少，可延長精子的體外存活時(shí)間，并使其受精能力得到維持。兔精液采集后，如果快速從體溫下降到0 ℃會(huì)導(dǎo)致精子大量死亡，因?yàn)闇囟葎×易兓率咕蛹?xì)胞膜中相關(guān)的脂類發(fā)生變化，導(dǎo)致膜流動(dòng)性下降，進(jìn)而阻礙蛋白質(zhì)的運(yùn)動(dòng)和組裝，最終導(dǎo)致精子膜的選擇通透性喪失，膜上酶的活性下降，膜通道調(diào)節(jié)失控，所以應(yīng)根據(jù)精液液態(tài)保存方法選擇合適的降溫速度對精液進(jìn)行降溫并保存[14]。

2.1.3 稀釋液成分 兔精液液態(tài)保存的稀釋液可以在一定程度上使精子的代謝降低，體外存活時(shí)間延長且提高精液的利用率。對于稀釋液來說，營養(yǎng)劑和保護(hù)劑是其主要組成部分。營養(yǎng)劑主要有葡萄糖、蔗糖、卵黃和奶類等，可以提供精子在體外生存所需的養(yǎng)分，并為精子補(bǔ)充能量。此外，加入的糖類可以和細(xì)胞膜上的磷脂作用起到保護(hù)精子膜的作用[15，16]。卵黃和奶類還可以調(diào)節(jié)稀釋液的滲透壓，使精液中電解質(zhì)的濃度降低、防止精子膜被破壞[10，16]。稀釋液中的保護(hù)劑主要是緩沖物質(zhì)和其他一些添加物，緩沖物質(zhì)包括檸檬酸、磷酸二氫鉀和磷酸二氫鈉等，這些緩沖物質(zhì)可以中和精子代謝過程中產(chǎn)生的酸以及使相應(yīng)的酶反應(yīng)得到很好的緩沖。另外，在兔精液稀釋液中也會(huì)加入相應(yīng)的抗生素如青霉素和鏈霉素等，主要是抑制病原微生物對精子的危害。研究表明，維生素C和維生素E對精子有一定的保護(hù)作用[17]，在兔精液稀釋液中加入一定量的維生素C后可以提高兔精子的活力、存活時(shí)間和生存指數(shù)[9]；還有研究表明，加入?；撬釋ν镁旱谋４嬉簿哂辛己玫男Ч鸞18]。

2.1.4 稀釋液滲透壓 稀釋液的滲透壓對精子活力的影響是至關(guān)重要的，兔精液稀釋保存時(shí)滲透壓不能過高也不能過低，一般有利于保護(hù)精子相應(yīng)功能的介質(zhì)應(yīng)是等滲或稍高滲[10]；非離子物質(zhì)如葡萄糖等主要參與稀釋液滲透壓的維持。此外，稀釋液的離子強(qiáng)度在精子的體外保存過程中可能不起主要的作用，但精子表面蛋白溶解脫落而導(dǎo)致的精子損傷卻是離子強(qiáng)度過高造成的。

2.2 影響兔精液冷凍保存的因素

2.2.1 冷凍保存稀釋液 兔精液在冷凍保存之前需要進(jìn)行一定的稀釋，精液冷凍保存的效果會(huì)因稀釋液成分的不同以及同一稀釋液所稀釋的比例不一樣而發(fā)生變化。目前，以Tris、葡萄糖和檸檬酸作為主要成分配制的稀釋液最符合兔精液特性，但精液保存效果也受到這些稀釋液濃度的影響[19，20]。

2.2.2 冷凍保護(hù)劑 精子的冷凍過程會(huì)對精子產(chǎn)生損傷，通過在稀釋液中添加冷凍保護(hù)劑則可以使精子所受到的損傷降低。目前，常用甘油、乙二醇和DMSO等滲透性抗凍保護(hù)劑來降低冷凍過程中冰晶化對精子造成的損傷。此外，還會(huì)添加一些對精子膜穩(wěn)定性起到保護(hù)作用的物質(zhì)，如添加一定量的海藻糖可以顯著改善兔精子的運(yùn)動(dòng)性、頂體完整性、質(zhì)膜完整性和線粒體活性等[13]。稀釋液中加入一定量的蔗糖等大分子聚合物可以提高其粘度，在冷凍過程中可以更好地保護(hù)精子[15，16]。另外，加入一定量的甘氨酸也可以在精子的冷凍保存中起到很好的保護(hù)效果[21]。對于兔精液而言，其冷凍保護(hù)效果會(huì)因冷凍保護(hù)劑的不同而發(fā)生明顯差異。如果在兔精液的冷凍保存過程中只添加甘油作為冷凍保護(hù)劑，那么其所表現(xiàn)出的冷凍保護(hù)效果會(huì)比使用其他冷凍保護(hù)劑的效果差；甘油雖然可以作為多數(shù)家畜精液最適的冷凍保護(hù)劑，但在兔精液的冷凍保存中并非如此，因?yàn)楦视捅旧頃?huì)對兔精子產(chǎn)生不良影響[4]。在兔精液的冷凍保存過程中，一般會(huì)使用高滲透性的DMSO作為冷凍保護(hù)劑，其毒性較甘油小，但是DMSO在一定程度上會(huì)破壞精子頂體的完整性，而在稀釋液中添加海藻糖等非滲透性保護(hù)劑則可以降低頂體所受到的損傷。研究表明，在兔精子冷凍保存過程中，稀釋液中加入卵黃也可以對精子起到保護(hù)作用[16]。

2.2.3 稀釋液滲透壓 正常情況下，精子的滲透壓與精漿的滲透壓保持一致。若冷凍保存所用的稀釋液滲透壓較精子內(nèi)部的高，則會(huì)導(dǎo)致精子脫水，進(jìn)而造成精子皺縮；如果精子內(nèi)的滲透壓較稀釋液的高，精子便會(huì)吸水膨脹，進(jìn)而發(fā)生破裂。因此，精子內(nèi)的滲透壓會(huì)隨著稀釋液滲透壓的不同而發(fā)生一定的變化，但稀釋液的滲透壓如果超出精子滲透壓的閾值，精子的代謝和活力就會(huì)受到嚴(yán)重影響[22]。研究表明，中性或酸性的低滲溶液對家兔精子的影響更大[4]。

2.2.4 平衡和熏蒸時(shí)間 精液冷凍保存的效果會(huì)因降溫和平衡時(shí)間的長短而發(fā)生一定的變化。一般來說，平衡時(shí)間在30～120 min不等，因?yàn)槔鋬霰Ｗo(hù)劑濃度的高低也會(huì)影響平衡時(shí)間，因此要根據(jù)實(shí)際情況來確定合適的平衡時(shí)間[23]。同樣，熏蒸時(shí)間也會(huì)對精液冷凍保存效果產(chǎn)生影響，因?yàn)槔鋬霰Ｗo(hù)劑及其濃度也會(huì)影響熏蒸時(shí)間，目前，熏蒸時(shí)間以10～15 min為宜[4，24]。

2.2.5 抗氧化劑 在精液冷凍過程中，精子必然會(huì)受到低溫脅迫，進(jìn)而提高其活性氧水平，因?yàn)樵谄胶膺^程中，精子暴露在空氣里，而空氣中的氧濃度較生殖道中的高[25]。此外，精子也會(huì)受稀釋液中的金屬離子影響，其導(dǎo)致精子在冷凍過程中產(chǎn)生更多的活性氧，從而使精子出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷。因此，在精液的冷凍保存過程中，需要加入一些抗氧化劑來減小精子受到的損傷?？寡趸瘎┰谪i和牛等家畜的精液保存中研究得較為深入，但在兔精液保存方面的研究相對較少。目前在兔子上的一些研究表明，在稀釋液中加入一定濃度的半胱氨酸會(huì)保護(hù)精子不受活性氧的損傷[4，26]。此外，在兔精液冷凍保存液中加入一定量的谷氨酰胺和維生素E也可以保護(hù)精子的活力、頂體完整性以及防止精子脂質(zhì)過氧化，進(jìn)一步提高兔精液的冷凍保存效果[12，23]。

3 結(jié)語

人工授精技術(shù)的應(yīng)用極大促進(jìn)了現(xiàn)代畜牧業(yè)的發(fā)展，而精液保存是制約人工授精技術(shù)廣泛應(yīng)用的重要一環(huán)。如果優(yōu)良種公畜的精液保存得當(dāng)，則可以進(jìn)行長途運(yùn)輸，進(jìn)而擴(kuò)大精液的使用范圍，增加受配母畜頭數(shù)和提高種公畜的配種效率。雖然對兔精液保存的研究較早，但是進(jìn)展仍然緩慢。目前，在商品兔生產(chǎn)中應(yīng)用較多的仍是精液現(xiàn)采現(xiàn)用。在生產(chǎn)實(shí)踐中對兔精液的保存，尤其是低溫保存和冷凍保存的研究工作還較少，仍需要進(jìn)一步對兔精液的低溫和超低溫保存技術(shù)進(jìn)行探討。只有揭示出兔精子保存過程中的生理變化以及分子機(jī)制，才能優(yōu)化精液稀釋液成分和精液保存體系，進(jìn)一步建立兔精液的高效保存方法，使優(yōu)良種公兔遺傳資源得到充分利用，進(jìn)而推動(dòng)養(yǎng)兔業(yè)更好的發(fā)展。

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