張 宇，鄭為超，李 冬，牛 凱

(1. 同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院檢驗科，上海 200065；2. 安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，安徽 淮南 232001)

椎間盤退變性疾病(degenerative disc disease, DDD)已成為嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量的高發(fā)病[1]。目前除生物力學(xué)改變?yōu)槠洳∫蛲?，IL-1β、TNF-α等炎癥因子在發(fā)病過程中的重要性逐漸被認(rèn)識。研究證實，IL-1β在軟骨細(xì)胞退變及凋亡過程中處于關(guān)鍵地位，是椎間盤退行性病變的病因之一[2-4]。前期研究發(fā)現(xiàn)，活血化瘀代表藥紅花提取物羥基紅花黃素A(hydroxy safflower yellow A，HSYA)具有調(diào)控IL-1β信號通路，延緩軟骨終板細(xì)胞凋亡的作用[5]，但具體機制尚不明確。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，HSYA能夠改變退變軟骨終板細(xì)胞周期，可能是HSYA抑制退變軟骨終板細(xì)胞凋亡的機制之一。

1 材料

1.1實驗動物健康昆明種小鼠，♀♂各半，SPF級，4周齡，購自上海萊克實驗動物有限責(zé)任公司，許可證編號：SCXK(滬)2007-0005。

1.2試劑完全培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清，購自Gibco公司；胰蛋白酶購自Promega公司；細(xì)胞因子IL-1β購自Prospec公司；增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、p53、p21抗體，均購自Santa cruz公司；β-actin抗體購自CST公司；Dylight二抗購自上海西美杰公司；Ⅱ型膠原酶購自Sigma公司；CCK-8試劑盒購自DOJINDO公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq試劑盒，購自大連寶生公司；引物為Invitrogen公司上海合成部生產(chǎn)；碘化丙啶為北京寶賽公司產(chǎn)品。

1.3儀器BNA-311型培養(yǎng)箱(Espec公司)；酶標(biāo)儀(美國Themo公司)；Odyssey近紅外掃描儀(美國LICOR公司)；FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；CFX96 PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1椎間盤軟骨終板細(xì)胞的分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)、分組將小鼠斷頸處死。無菌的條件下剪開背部皮膚，體視學(xué)顯微鏡下用手術(shù)刀削取L1-L5椎間盤軟骨，放入PBS培養(yǎng)皿中，清除血污及其它組織。用含100 kU·L-1青-鏈霉素的PBS緩沖液沖洗后，移入超凈臺，將軟骨組織盡量剪碎。加入2 g·L-1的Ⅱ型膠原酶3 mL，將培養(yǎng)皿放置恒溫?fù)u箱中，37℃消化3～4 h。大部分細(xì)胞游離時，采用移液器將細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液，加入3 mL體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中和后，用15 mL離心管收集細(xì)胞，在低溫離心機中1 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打，使細(xì)胞懸液均勻分布。待細(xì)胞長至90%時，傳代分組。正常組換成含1%胎牛血清的DMEM，誘導(dǎo)組換成誘導(dǎo)培養(yǎng)基(IL-1β濃度為10 μg·L-1的含1%胎牛血清DMEM)后培養(yǎng)，給藥組用不同濃度HSYA加誘導(dǎo)培養(yǎng)基。如：細(xì)胞增殖檢測、流式細(xì)胞儀分析、real-time PCR檢測的實驗分為6組：正常組、誘導(dǎo)組、4組給藥組。其中，給藥組HSYA濃度分別為10-4、10-5、10-6、10-7mol·L-1；Western blot給藥組HSYA濃度為10-5mol·L-1。

2.2CCK-8法檢測不同時間點各組細(xì)胞增殖情況將第3代軟骨細(xì)胞按4×104個接種于2塊96孔酶標(biāo)板中，每孔100 μL，除6組實驗組外，設(shè)立空白對照組，不接種細(xì)胞，每組3個復(fù)孔。分別培養(yǎng)1、3、5、7、9 d。換新鮮DMEM 100 μL，每孔內(nèi)加新鮮配制的CCK-8溶液10 μL，37℃孵育2 h后，振蕩2 min。在全自動酶標(biāo)儀上檢測光密度OD值，檢測波長為450 nm。

2.3流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期消化細(xì)胞大約5×105個，PBS漂洗后，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇制成單細(xì)胞懸液，固定過夜，次日1 500 r·min-1離心5 min，棄上清，PBS漂洗后，加入終濃度為20 mg·L-1RNAnase ，37°C消化1 h，離心棄上清，加入碘化丙啶5 min后，上機檢測。

2.4Real-timeRT-PCR檢測細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)基因p53、Bax、Bcl-2mRNA的表達(dá)提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度儀檢測RNA含量和純度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件如下：37℃ 15 min，85℃ 5 s。Real-time PCR反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Premix Ex Taq 10 μL，去離子水7 μL，上、下游引物各1 μL，模板cDNA 1 μL。反應(yīng)過程如下：95℃預(yù)變性10 min，進入循環(huán)，95℃變性20 s，退火5 s(p53、Bax、Bcl-xl、β-actin的退火溫度分別為58℃、60℃、56℃、58℃)，72℃延伸20 s，循環(huán)擴增，循環(huán)次數(shù)均為40次，最終72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，以每一樣體所含p53、Bax、Bcl-xl mRNA的拷貝數(shù)和其β-actin內(nèi)參基因的拷貝數(shù)的比值進行比較。采用-△△CT法比較各組基因表達(dá)情況。引物序列如下：p53上游引物5′-GCTCACCCTGGCTAAAGTTCTG-3′，下游引物5′-AGTCGCTACCTACAGCCAGGAT-3′；Bax上游引物5′-GGTT GCCCTCTTCTACTTTGC-3′，下游引物5′-TCTTCCAG ATGGTGAGCGAG-3′；Bcl-xl上游引物5′-CCCCCCA CATCTCAGTTCTCT-3′，下游引物5′-GCCTCCAAGG AGCTGGTTTAG-3′；β-actin上游引物5′-GGAGATT ACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游引物5′-GACTCA TCGTACTCCTGCTTGCTG-3′。

2.5Western blot檢測蛋白表達(dá)以每孔每毫升1×105個細(xì)胞，放置于6 cm培養(yǎng)皿中。用RIPA試劑裂解細(xì)胞。測定蛋白濃度，確保每個蛋白樣品的上樣量一致。沸水中蛋白變性5 min，4℃冷卻，待用。12%的SDS-PAGE分離膠，取20 μL樣品(約30 μg蛋白)上樣，以100 V恒壓電泳。300 mA，90 min轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5% BSA的TBST室溫封閉1 h。一抗(1 ∶1 000)4℃孵育過夜。TBST洗膜2次，每次10 min，用Dylight標(biāo)記相應(yīng)二抗室溫孵育30 min。TBS(0.1 mol·L-1NaCl，0.1 mol·L-1Tris-HCl，pH7.5)洗膜3次，每次10 min，在紅外激光成像系統(tǒng)Odeyssey上成像。數(shù)據(jù)用樣品與β-actin的比值表示。

3 結(jié)果

3.1HSYA對退變軟骨細(xì)胞增殖的影響各組大約在5 d開始進入對數(shù)生長期，7 d后進入平臺期，9 d后逐漸進入衰退期，其中，誘導(dǎo)組相對于正常對照組，進入對數(shù)生長期起峰較低，且進入平臺期OD值也低于正常對照組，各HSYA給藥組對數(shù)生長期及平臺期OD值均高于誘導(dǎo)組。與正常對照組比較，誘導(dǎo)組IL-1β在不同時間段對軟骨終板細(xì)胞增殖均具有抑制作用。不同濃度的HSYA均可拮抗IL-1β對軟骨細(xì)胞增殖的抑制作用，與誘導(dǎo)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，HSYA各濃度組之間比較差異無顯著性，見Tab 1。

Tab 1 Proliferation of cartilage endplates in each group n=3)

#P<0.05vsnormal;*P<0.05vsinduced

3.2HSYA對退變軟骨細(xì)胞周期的影響如Fig 1所示，誘導(dǎo)組S期比例較正常組S期比例高，各給藥組S期細(xì)胞比例較誘導(dǎo)組低，其中以HSYA(10-5、10-6mol·L-1)組最為接近正常組。

3.3HSYA對退變軟骨細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)的影響加藥24、48 h后，分別檢測各組mRNA。如Fig 2所示，誘導(dǎo)組p53 mRNA表達(dá)較正常組高，各給藥組p53 mRNA表達(dá)量低于誘導(dǎo)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中，以HSYA 10-5mol·L-1組p53表達(dá)最低；誘導(dǎo)組Bcl-xl mRNA表達(dá)低于正常組及HSYA給藥組；誘導(dǎo)組Bax mRNA表達(dá)高于正常組及HSYA給藥組。

3.4HSYA對退變軟骨細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響如Fig 3所示，加藥培養(yǎng)24 h后，HSYA 10-5mol·L-1組PCNA蛋白表達(dá)量較誘導(dǎo)組高，較正常組低；誘導(dǎo)組p53、p21表達(dá)高于正常組及HSYA 10-5mol·L-1組。

4 討論

軟骨終板細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致椎間盤退變的重要原因之一[6-7]。炎癥因子IL-1β的表達(dá)和釋放，可導(dǎo)致軟骨終板細(xì)胞的凋亡及退變[8]。因此，減少IL-1β分泌，拮抗其作用，可以延緩椎間盤退變進程。正常軟骨細(xì)胞中，p53與Puma結(jié)合，無生物學(xué)活性。炎癥因子作用下，p53被激活，核內(nèi)p53水平增加，轉(zhuǎn)錄激活Puma，Puma與p53解離后與Bcl-xL的結(jié)合，釋放p53，p53直接激活Bax，改變線粒體通透性，促進細(xì)胞凋亡[9]。HSYA能夠通過下調(diào)p53蛋白表達(dá)，發(fā)揮抑制退變細(xì)胞凋亡的作用。

炎癥刺激下，DNA損傷后，可引起p53依賴的細(xì)胞周期阻滯，p53表達(dá)升高，激活下游分子p21[10]。后者通過C端結(jié)構(gòu)域與不溶性PCNA結(jié)合，抑制其活性，阻止損傷DNA長鏈復(fù)制。不溶性PCNA在G0-G1期細(xì)胞中無明顯表達(dá)，G1晚期，其表達(dá)大幅度增加，S期達(dá)到高峰，G2-M期明顯下降，其量的變化與DNA合成一致，檢測其在細(xì)胞中的表達(dá)，可作為評價細(xì)胞增殖狀態(tài)的一個指標(biāo)[11]。實驗結(jié)果顯示，軟骨終板細(xì)胞退變后PCNA表達(dá)下降，HSYA可一定程度上調(diào)PCNA表達(dá)，這與細(xì)胞增殖檢測結(jié)果相同，提示HSYA能夠部分拮抗IL-1β抑制細(xì)胞增殖的作用，上調(diào)PCNA表達(dá)。流式結(jié)果顯示，退變后細(xì)胞S期增高，則可能是由于IL-1β導(dǎo)致DNA損傷后，細(xì)胞首先啟動損傷感應(yīng)機制，細(xì)胞生長發(fā)生停滯，繼而啟動DNA修復(fù)，修復(fù)成功細(xì)胞可進入下一周期，修復(fù)失敗細(xì)胞將啟動凋亡機制[12-13]。正常組及各藥物組細(xì)胞已進入下一周期，而退變細(xì)胞組細(xì)胞生長停滯，進行DNA修復(fù)，S期

Fig 1 Results of testing cell cycle after 24 h administration

Fig 2 The mRNA expression levels of Bcl-xl (A),

A. The mRNA expression levels of Bcl-xl in each group, after administrated for 24 and 48 hours; B. The mRNA expression levels of Bax in each group, after administrated for 24 and 48 hours; C. The mRNA expression levels of p53 in each group, after administrated for 24 and 48 hours;#P<0.05vsnormal group;*P<0.05vsinduced group

比例較高，細(xì)胞凋亡增加[11]。

前期實驗主要證實了IL-1β可誘導(dǎo)軟骨終板細(xì)胞發(fā)生退變及凋亡，HSYA具有拮抗IL-1β作用[5]，但其具體機制尚不明確。本研究通過對凋亡及細(xì)胞周期上游蛋白的檢測，進一步發(fā)現(xiàn)HSYA能夠改變退變軟骨細(xì)胞周期，這可能是其拮抗IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡的作用途徑之一。

Fig 3 The protein expression levels of PCNA, p53 and

#P<0.05vsnormal group;*P<0.05vsinduced group

綜上所述，本研究證實了HSYA具有上調(diào)PCNA，下調(diào)p53、p21的作用。HSYA可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，發(fā)揮其促進細(xì)胞增殖，抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨終板細(xì)胞凋亡的作用，提示HSYA具有改善椎間盤退變的潛能。

(致謝：本研究主要在上海市同濟醫(yī)院檢驗科實驗室及中心實驗室完成，感謝課題組成員在本研究過程中提供幫助與指導(dǎo)。)