王 涵,邵 英,朱茄慧,廖云鵬,馬 妍,任文艷, 周林云,吳 柯,何百成

(1. 重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 2. 重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，重慶 400016)

羅格列酮(rosiglitazone, RSG)可作為過(guò)氧化物酶體增殖體活化受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)的激動(dòng)劑，對(duì)2型糖尿病有明顯治療效果。但RSG長(zhǎng)期使用后可明顯致骨質(zhì)疏松，尤其是對(duì)年老女性患者[1]。據(jù)報(bào)道，RSG及其同類藥物可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cells, bMSCs)向脂肪細(xì)胞分化[2]，打破骨形成與骨吸收之間的平衡，引起骨質(zhì)疏松。目前，臨床上主要使用RSG與二磷酸鹽聯(lián)用治療2型糖尿病，預(yù)防由RSG所引起的骨質(zhì)疏松[3]。但是，二磷酸鹽本身也存在很多嚴(yán)重不良反應(yīng)，如房顫等[4]。因此，二磷酸鹽類藥物可能并非預(yù)防RSG所致骨質(zhì)疏松的最佳選擇。

間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞[5-6]，包括bMSCs以及C3H0T1/2和C2C12等。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)也具有多向分化潛能，可定向分化為成骨或脂肪細(xì)胞等。MEFs易于獲取，且基因組未進(jìn)行任何修飾，可能更適合用于干細(xì)胞定向分化研究。PPARγ是調(diào)節(jié)成脂分化關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子之一[7-8]，通過(guò)與類視黃醇X受體(retinoid X receptor，RXR)結(jié)合，調(diào)節(jié)bMSCs或其他干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化。研究表明，PPARγ對(duì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化也具有促進(jìn)作用[9]。因此，RSG可能對(duì)干細(xì)胞的成脂和成骨分化均具有重要作用。全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)是維生素A的重要代謝物之一，在胚胎和個(gè)體發(fā)育中具有重要的調(diào)節(jié)作用[10]。ATRA與維甲酸受體(retinoic acid receptor，RAR)或RXR結(jié)合，發(fā)揮對(duì)機(jī)體各種生物過(guò)程的調(diào)節(jié)作用[10-11]。研究表明，ATRA可促進(jìn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白9(bone morphogenetic protein 9, BMP9)誘導(dǎo)前體脂肪細(xì)胞骨向分化的作用[12]。因此，RSG與ATRA合用可能對(duì)干細(xì)胞骨向分化有調(diào)節(jié)作用。本研究主要分析RSG與ATRA聯(lián)合應(yīng)用能否誘導(dǎo)干細(xì)胞定向骨分化，及介導(dǎo)該過(guò)程的可能分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞株 NIH孕鼠(E12.5)購(gòu)于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。成肌細(xì)胞C2C12和間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2購(gòu)買于美國(guó)ATCC(American Type Culture Collection)。實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞培養(yǎng)條件為5% CO2和37℃，采用高糖DMEM(含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素、0.1 g ·L-1鏈霉素)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.1.2試劑 一抗OPN、OCN、RUNX2、Smad1/5/8、p-Smad1/5/8、GAPDH、C/EBPα等，均購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司。ATRA由重慶華邦制藥饋贈(zèng)；羅格列酮購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，二者均采用DMSO為溶媒。

1.1.3儀器 CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司), 倒置熒光顯微鏡(日本Nikon)，化學(xué)發(fā)光和熒光測(cè)定儀(美國(guó)BIOSCAN公司)，臺(tái)式低溫離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)，定量PCR儀(Bio-Rad公司)，垂直電泳槽、濕式轉(zhuǎn)膜儀(北京六一)。

1.2小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)的提取MEFs細(xì)胞從 NIH小鼠12.5 d的胚胎中提取獲得。將胎鼠去除內(nèi)臟后，用手術(shù)刀切成小塊，用1 mL 0.25%的胰蛋白酶在37℃消化15 min， 然后加入10 mL含血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。最后，將其放入100 mm的培養(yǎng)皿中37℃培養(yǎng)24 h， 貼壁的細(xì)胞即為MEFs。

1.3RNA提取以及聚合酶鏈反應(yīng)將細(xì)胞種到T25培養(yǎng)瓶中，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用相應(yīng)因素處理。采用TRIzol法提取總RNA，然后通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。將得到的cDNA稀釋10倍，作為定量PCR和常規(guī)PCR的模板。實(shí)驗(yàn)所涉及到的引物序列詳見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Primer sequences used in this investigation

1.4Westernblot實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞用0.25%的胰酶消化后接種到6孔板中，細(xì)胞貼壁后，分別加入RSG、ATRA或RSG+ATRA等處理因素。加入同體積的DMSO作為對(duì)照組，ATRA和RSG的終濃度分別是0.4 μmol·L-1和20 μmol·L-1。分別提取1、2、9、11 d的蛋白后，用10%的聚丙烯胺凝膠進(jìn)行電泳，按常規(guī)Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)行操作。 最后用凝膠成像儀進(jìn)行成像。結(jié)果均重復(fù)3次。

1.5堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)活性檢測(cè)將細(xì)胞用0.25%的胰酶消化后接種到24孔板培養(yǎng)板中，用RSG、ATRA、RSG+ATRA分別處理MEFs細(xì)胞(同體積的DMSO作為空白對(duì)照組)，ATRA和RSG的濃度分別為0.4 μmol·L-1和20 μmol·L-1。于d 5、7按BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，檢測(cè)ALP的活性。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6茜素紅染色將細(xì)胞消化后接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，并按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入相應(yīng)處理因素。細(xì)胞培養(yǎng)21 d后進(jìn)行茜素紅染色，檢測(cè)基質(zhì)礦化的形成情況。步驟簡(jiǎn)述如下： 棄去培養(yǎng)基后，PBS洗3次，加入2.5%戊二醛固定20 min，棄戊二醛后，用pH為4.2的PBS洗1次，再用茜素紅工作液孵育30 min。最后，棄染液并用水清洗即可。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7油紅O染色將細(xì)胞種于24孔培養(yǎng)板中，并加入相應(yīng)處理因素，于14 d后，進(jìn)行油紅O染色。棄去培養(yǎng)基后PBS洗2遍，10%甲醛固定30 min后，用PBS清洗。用新鮮配制的油紅O工作液孵育30 min，用水清洗后進(jìn)行拍照。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒檢測(cè)實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞消化后種到T25培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁后采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染2 μg報(bào)告質(zhì)粒。16 h后，將細(xì)胞重新消化并種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在細(xì)胞貼壁后加入相應(yīng)因素進(jìn)行處理。24 h后將細(xì)胞裂解，按試劑盒操作說(shuō)明測(cè)定報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄活性。采用BCA法測(cè)定總蛋白濃度，用于校正螢光素酶活性。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1PPARγ、RAR、RXR受體及其亞型在干細(xì)胞中的表達(dá)情況本研究主要目的是分析RSG誘導(dǎo)的干細(xì)胞成脂分化是否可以在ATRA存在的情況下向成骨分化。RSG是PPARγ的激動(dòng)劑，而ATRA則是RAR和RXR的激動(dòng)劑。因此，本研究首先分析這些受體在干細(xì)胞中的表達(dá)情況。Fig 1定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，以上受體在C2C12、C3H10T1/2、MEFs等細(xì)胞中均有表達(dá)。結(jié)果提示， RSG和ATRA在這些干細(xì)胞中可與相應(yīng)的受體相結(jié)合發(fā)揮調(diào)控功能。由于MEFs是原代細(xì)胞，其基因組未經(jīng)過(guò)任何修飾，所以本研究選用MEFs進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Fig 1 Endogenous expression of PPARγ , RXR and RAR in C2C12, C3H10T1/2 and MEFs

1：PPARγ；2：RXRα；3：RXRβ；4：RXRγ；5：RARα；6：RARβ；7：RARγ. Quantitative PCR analysis results showed the endogenous expression level of PPARγ and the different isoforms of RXR and RAR in the available cell lines and MEFs. The results were expressed as the ratio of mRNA expression level of each receptor to corresponding GAPDH expression

2.2RSG和ATRA對(duì)MEFs細(xì)胞ALP活性的影響本研究首先檢測(cè)RSG或ATRA在MEFs細(xì)胞中對(duì)ALP活性的影響。結(jié)果表明，ATRA濃度依懶性地明顯增強(qiáng)MEFs細(xì)胞中ALP活性，即使?jié)舛仍?.1 μmol·L-1時(shí)也具有促進(jìn)作用(Fig 2A、2C)。RSG能增強(qiáng)MEFs細(xì)胞的ALP活性，但所需最低濃度明顯高于ATRA(Fig 2B、2D)。以上結(jié)果表明， RSG或ATRA都有增加MEFs細(xì)胞ALP活性的潛能。本研究進(jìn)一步分析RSG和ATRA之間是否存在協(xié)同誘導(dǎo)MEFs細(xì)胞ALP活性的作用。結(jié)果顯示，在MEFs細(xì)胞中，RSG可促進(jìn)ATRA誘導(dǎo)的ALP活性(Fig 2E)；同樣，ATRA也明顯促進(jìn)RSG誘導(dǎo)的ALP活性。以上結(jié)果提示，RSG與ATRA或許可以促進(jìn)MEFs細(xì)胞定向骨分化。

2.3RSG和ATRA在MEFs中對(duì)成骨指標(biāo)表達(dá)和鈣鹽沉積的影響雖然RSG 與ATRA合用可增強(qiáng)MEFs細(xì)胞中ALP的活性，但還不足以說(shuō)明兩者聯(lián)用可促進(jìn)骨干細(xì)胞分化。因此，本研究繼續(xù)進(jìn)行相關(guān)成骨分化實(shí)驗(yàn)分析。Western blot分析結(jié)果顯示， RSG合用ATRA不僅促進(jìn)OPN和OCN表達(dá)(Fig 3A)，還明顯誘導(dǎo)鈣鹽沉積(Fig 3B～3D)。但RSG或ATRA單獨(dú)處理MEFs細(xì)胞時(shí)，并未出現(xiàn)明顯鈣鹽沉積。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，RSG聯(lián)合ATRA至少在體外可誘導(dǎo)MEFs細(xì)胞定向骨分化。

硬件電路設(shè)計(jì)則選用TPS43000作為PWM控制器；采用同步BOOST電路為電源轉(zhuǎn)換電路。為了降低開(kāi)關(guān)管的損耗，開(kāi)關(guān)管的導(dǎo)通電阻應(yīng)盡量小，NMOS 開(kāi)關(guān)管選擇 Si4866DY，其RDS（ON）為 10 mΩ；PMOS開(kāi)關(guān)管選擇 Si4403DY，其RDS（ON）為 17 mΩ。參數(shù)設(shè)計(jì)同仿真設(shè)計(jì)相同，如表1所示。電路原理圖如圖9所示。

2.4ATRA和RSG對(duì)MEFs成脂分化的影響以上結(jié)果證實(shí)，RSG聯(lián)合ATRA可促進(jìn)MEFs骨向分化，但相關(guān)作用分子機(jī)制目前尚不明確。RSG導(dǎo)

Fig 2 Effects of RSG or/and ATRA on ALP activities in MEFs

A: ALP staining results showed the effect of ATRA on ALP activities in MEFs; B: ALP staining results showed the effect of RSG on ALP activities in MEFs; C: ALP activity assay results showed the effect of ATRA on ALP activities in MEFs; D: ALP activity assay results showed the effect of RSG on ALP activities in MEFs.**P<0.01vscontrol; E: ALP staining results showed the effect of RSG on ATRA-induced ALP activities in MEFs; F: ALP staining results showed the effect of ATRA on RSG-induced ALP activities in MEFs; G: ALP activities assay results showed the effect of RSG on ATRA-induced ALP activities in MEFs; H: ALP activities assay results showed the effect of ATRA on RSG-induced ALP activities in MEFs.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsRSG or ATRA treated group.

致骨質(zhì)疏松的主要原因是bMSCs向脂肪細(xì)胞分化所致。因此，ATRA聯(lián)合RSG誘導(dǎo)MEFs骨向分化可能與干擾脂肪分化有關(guān)。油紅O染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RSG處理組脂滴增加明顯，ATRA處理組無(wú)明顯脂滴生成，RSG合并ATRA組脂滴生成明顯減少(Fig 4A、4B)。 Western blot結(jié)果顯示，RSG 在MEFs

Fig 3 Effects of RSG and/or ATRA on different osteogenic markers in MEFs

A: Western blot assay results showed the effect of RSG and/or ATRA on the expression of OPN and OCN in MEFs. GAPDH was used as loading control; B: Alizarin Red S staining results showed the effect of RSG and/or ATRA on matrix mineralization in MEFs; C: Quantification results of Alizarin Red S staining showed the effect of RSG and/or ATRA on matrix mineralization in MEFs.**P<0.01vscontrol; D: Representative images for Alizarin Red S staining results showed the effect of RSG and/or ATRA on matrix mineralization in MEFs.

中明顯誘導(dǎo)C/EBPα表達(dá)，ATRA抑制C/EBPα表達(dá)，且明顯降低RSG誘導(dǎo)的C/EBPα表達(dá)(Fig 4C、4D)。 以上結(jié)果提示，RSG與ATRA合用促進(jìn)MEFs骨向分化的作用可能與ATRA抑制RSG誘導(dǎo)成脂分化有關(guān)。

2.5RSG與ATRA對(duì)MEFs中BMP/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響Runx2是成骨分化調(diào)節(jié)重要的早期轉(zhuǎn)錄因子之一，報(bào)告質(zhì)粒檢測(cè)結(jié)果顯示，ATRA聯(lián)用RSG明顯增加Runx2熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性(Fig 5A)；Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，RSG與ATAR均增加Runx2表達(dá)，兩者聯(lián)合明顯增加Runx2在MEFs細(xì)胞中的蛋白水平(Fig 5B)。作為一種重要的成骨分化轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，Runx2受到BMP/Smad信號(hào)調(diào)節(jié)。熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒分析結(jié)果顯示，RSG對(duì)報(bào)告質(zhì)料的轉(zhuǎn)錄活性無(wú)影響，ATRA可增加其轉(zhuǎn)錄活性；ATRA與RSG聯(lián)合應(yīng)用時(shí)報(bào)告質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性明顯增加(Fig 5C)。Western blot結(jié)果顯示，RSG可增加p-Smad1/5/8的水平，但這種作用不如ATRA明顯，兩者合用明顯增加p-Smad1/5/8的水平(Fig 5D)。PCR結(jié)果顯示，ATRA與RSG合用明顯增加Smad6的表達(dá)，但對(duì)Smad7表達(dá)有抑制作用(Fig 5E)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，ATRA與RSG聯(lián)合應(yīng)用促進(jìn)MEFs骨向分化的機(jī)制可能也與增強(qiáng)BMP/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性有關(guān)。

3 討論

RSG及其同類藥物對(duì)2型糖尿病具有較好的治療效果，但長(zhǎng)期使用可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。本研究發(fā)現(xiàn)， RSG與ATRA聯(lián)用可以誘導(dǎo)MEFs定向骨分化。這種作用可能與RSG和ATRA聯(lián)用抑制脂肪分化，以及增加BMP/Smad的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性有關(guān)。因此，ATRA可能對(duì)RSG及其類似藥物所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松具有預(yù)防或治療作用。

Fig 4 Effects of RSG and/or ATRA on adipogenic differentiation in MEFs

A: Oil Red O staining results showed the effect of RSG and/or ATRA on the adipogenesis in MEFs; B: Quantification of Oil Red O staining results showed the effect of RSG and/or ATRA on the adipogenesis in MEFs; C: Western blot assay results showed the effect of RSG and/or ATRA on the expression of C/EBPα in MEFs. GAPDH was used as loading control; D: Quantification of Western blot assay results showed the effect of RSG and/or ATRA on the expression of C/EBPα in MEFs.#P<0.05,##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsRSG.

RSG可增加機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性而對(duì)2型糖尿病有明顯療效。但由于RSG能促進(jìn)bMSCs向脂肪細(xì)胞分化，所以長(zhǎng)期使用可致骨質(zhì)疏松，尤其是對(duì)年老的女性患者[1]。目前，臨床上常用RSG與二磷酸鹽合用治療2型糖尿病，以減輕RSG對(duì)骨代謝平衡影響。二磷酸鹽可在某種程度上預(yù)防骨密度的降低[7]，但并不能抑制RSG誘導(dǎo)bMSCs成脂分化；同時(shí)，二磷酸鹽本身也具有上消化道不良反應(yīng)、下頜骨壞死以及房顫等不良反應(yīng)[7]。因此，二磷酸鹽類藥物可能并不是預(yù)防RSG等所導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的最佳選擇。雖然RSG作為PPARγ激動(dòng)劑可誘導(dǎo)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，但當(dāng)PPARγ沉默后，干細(xì)胞骨向分化的能力同樣也減弱。ATRA作為維生素A的重要代謝物之一，可與RAR或RXR結(jié)合形成異二聚體，發(fā)揮ATRA對(duì)機(jī)體生理功能的調(diào)節(jié)作用。目前，ATRA對(duì)干細(xì)胞骨向分化存有爭(zhēng)議：有研究認(rèn)為，ATRA能抑制成骨分化且在高濃度時(shí)會(huì)誘發(fā)骨質(zhì)疏松[12]；但課題組前期研究表明，ATRA能增加BMP9所誘導(dǎo)的干細(xì)胞成骨分化。這種不同的結(jié)果可能與ATRA的濃度(或劑量)、細(xì)胞種類以及誘導(dǎo)因子有關(guān)。以上研究提示，PPARγ信號(hào)可參與調(diào)節(jié)并促進(jìn)干細(xì)胞骨向分化；同時(shí)，RSG與ATRA合用可能會(huì)促進(jìn)干細(xì)胞骨向分化。

Fig 5 Effects of RSG and/or ATRA on expression of Runx2 and BMPs/Smads signal transduction in MEFs

A: Luciferase reporter assay results showed the effect of RSG and/or ATRA on the transcriptional activities of p6×OSE-Luc reporter; B: Western blot results showed the effect of RSG and/or ATRA on the expression of Runx2 in MEFs. GAPDH was used as loading control; C: BMPR Smads binding elements luciferase reporter (p12×SBE-Luc) assay results showed the effect of RSG and/or ATRA on the activation of BMPs/Smads signaling transduction in MEFs; D: Western blot assay results showed the effect of RSG and/or ATRA on the level of Smad1/5/8 and p-Smad1/5/8 in MEFs. GAPDH was used as loading control; E: PCR assay results showed the effect of RSG and/or ATRA on the expression of Smad6 and Smad7.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

的重要調(diào)節(jié)信號(hào)之一。分析結(jié)果顯示，RSG與ATRA合用能促進(jìn)Runx2表達(dá)，促進(jìn)Smad1/5/8磷酸化和增加Smad6的mRNA水平。因此，RSG與ATRA合用促進(jìn)MEFs骨向分化可能與增加BMP/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性也有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)RSG與ATRA聯(lián)用可以誘導(dǎo)MEFs骨向分化, 機(jī)制可能與抑制脂肪分化和增加BMP/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性有關(guān)。該發(fā)現(xiàn)為預(yù)防RSG及其同類藥的骨質(zhì)疏松不良反應(yīng)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。