王 釗，鄭立卿

(河北北方學(xué)院藥學(xué)系, 河北 張家口 075000)

光動(dòng)力療法(photodynamic therapy，PDT)是一種美國(guó)FDA批準(zhǔn)的治療惡性腫瘤的新方法，起源于20世紀(jì)70年代，其原理是惡性腫瘤選擇性地?cái)z入并潴留光敏劑，在特定波長(zhǎng)光激發(fā)下，引發(fā)一系列光化學(xué)反應(yīng)，釋放出單態(tài)氧，殺死腫瘤組織，產(chǎn)生治療作用[1]。光敏劑是決定PDT療效的重要因素之一。癌光啉(代號(hào)：PSD-007)是由多種有活性血卟啉衍生物組成的混合物，如3，8-(1-甲氧乙基) -8(3) -乙?；?次卟啉Ⅸ(MVD)、3(8) -(1-甲氧乙基) -8 (3) -(1-羥乙基) -次卟啉 Ⅸ(MHD)、3， 8-二 (1-甲氧乙基) -次卟啉Ⅸ(DMD)、3 (8) -(1-羥乙基) -8 (3) -乙?；?次卟啉Ⅸ(HVD)、原卟啉Ⅸ(Pp)、血卟啉Ⅸ(HP)等[2]。與第1代光敏劑HpD相比，PSD-007具有避光時(shí)間短、單線態(tài)氧產(chǎn)率高、對(duì)腫瘤組織選擇性攝入率高、對(duì)正常組織毒性小、在人體正常組織內(nèi)代謝速度快等優(yōu)點(diǎn)，針對(duì)腫瘤治療有較好的療效，是國(guó)內(nèi)光敏劑研究的熱點(diǎn)。

氧化損傷是阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病重要的發(fā)病機(jī)制。具有清除氧自由基的中藥是治療神經(jīng)退行性疾病的熱點(diǎn)，抗氧化也是預(yù)防各種疾病的熱點(diǎn)。槲皮素(quercetin，Que)化學(xué)名為3，3′，4′，5，7-五羥基黃酮，存在于許多植物的花、葉、果實(shí)中，其藥理作用廣泛，具有抗癌、抗炎、心血管系統(tǒng)保護(hù)等作用，尤其具有明顯的抗氧化和清除自由基的作用[3-4]。茶多酚(tea polyphenol, TP) 屬黃烷醇類，是從綠茶葉中提取的多酚類物質(zhì)，是茶葉的主要活性成份之一，主要包括4種成分：表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表沒(méi)食子兒茶素、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素[5]。TP除具有抗突變、降血壓、降血脂、防治心血管疾病、抗氧化、抗菌消炎等功效外，還具有抑制淋巴細(xì)胞增殖[6]、降低高尿酸血癥、抗氧化作用[7]、抗癌防癌等活性[8]。實(shí)驗(yàn)表明TP可透過(guò)血腦屏障，清除自由基，提高Aβ?lián)p傷的神經(jīng)細(xì)胞的存活率，維持細(xì)胞內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整，保護(hù)腦細(xì)胞免受神經(jīng)毒素?fù)p傷[9]?？寡趸瘎?duì)PDT效應(yīng)的影響僅有少量報(bào)道，抗氧化劑對(duì)PDT效應(yīng)是否有影響尚有爭(zhēng)議。本研究利用PDT氧化損傷PC12細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上研究槲皮素、茶多酚對(duì)PDT效應(yīng)的影響，以期為黃酮類和多酚類化合物在PDT臨床治療方面的研究和利用積累資料。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞 (PC12細(xì)胞，無(wú)分化)，購(gòu)于北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)研究所細(xì)胞中心。槲皮素、茶多酚購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司(用DMSO溶劑配成儲(chǔ)備液)；PSD-007由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所激光醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；MTT購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2儀器CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Thermo公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；Safire2酶標(biāo)儀(美國(guó)TECAN公司)；3K30型高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；倒置顯微鏡(上海光學(xué)儀器)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)PC12 細(xì)胞接種于DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%小牛血清、50 kU·L-1青霉素、50 kU·L-1鏈霉素)，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每3～4 d傳代1次。待細(xì)胞呈對(duì)數(shù)期增長(zhǎng)時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率細(xì)胞以3×104/孔接種96孔板，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g·L-1)，37℃孵育4 h后，每孔加180 μL DMSO溶解甲臜藍(lán)紫色顆粒，震蕩混勻后，于570 nm測(cè)定各孔吸光度值(optical density，OD)。按下式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD570/空白對(duì)照組OD570)×100%。

1.5槲皮素和茶多酚對(duì)PC12細(xì)胞毒性檢測(cè)待PC12細(xì)胞呈對(duì)數(shù)期增長(zhǎng)時(shí)消化細(xì)胞，以每孔3×104細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100 μL。次日棄培養(yǎng)基，200 μL PBS洗1次細(xì)胞后，分別加入槲皮素(6.25、12.5、25、50、100 μmol·L-1)、茶多酚(6.25、12.5、25、50、100 μmol·L-1)的無(wú)血清培養(yǎng)基100 μL。于37℃、5% CO2條件下孵育24 h。PC12細(xì)胞空白對(duì)照組，不加其他干預(yù)。每組4個(gè)復(fù)孔取平均值，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。

1.6PSD-007介導(dǎo)的PDT對(duì)PC12細(xì)胞的殺傷作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔3×104個(gè)細(xì)胞。24 h后，加入光敏劑PSD-007溶液(終濃度0、3.125、6.25、12.5、25、50 mg·L-1)，每組4個(gè)復(fù)孔，避光孵育24 h測(cè)定暗毒性。孵育4 h后，換全培養(yǎng)基孵育2 h后，每孔給予630 nm激光照射，能量密度4.8 J/cm2(20 mW/cm2，4 min)。24 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率?？瞻讓?duì)照組PC12細(xì)胞不加其他干預(yù)，激光照射對(duì)照組僅以4.8 J/cm2激光照射。

1.7MTT法檢測(cè)槲皮素和茶多酚對(duì)PSD-007介導(dǎo)的PDT效應(yīng)的影響對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞接種于96孔板中。實(shí)驗(yàn)分為5組：空白對(duì)照組、PSD-007組(10 mg·L-1)、LASER組(激光照射4.8 J/cm2)、PDT損傷組(10 mg·L-1PSD-007，4.8 J/cm2)、槲皮素處理組(12.5、25、50 μmol·L-1)、茶多酚處理組(12.5、25、50 μmol·L-1)，每組4個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組不加任何干預(yù)。PDT損傷組加入10 mg·L-1的 PSD-007 100 μL，4 h后，以630 nm激光照射4 min，能量密度為4.8 J/cm2；槲皮素、茶多酚處理組分別加入槲皮素或茶多酚溶液100 μL，4 h后，分別加入10 mg·L-1的PSD-007溶液100 μL，4 h后，棄上清，加入全培養(yǎng)基100 μL。孵育2 h后，給予630 nm激光照射，能量密度為4.8 J/cm2。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的活性。

1.8LDH法檢測(cè)槲皮素和茶多酚對(duì)PSD-007介導(dǎo)PDT效應(yīng)的影響LDH正常情況下存在于細(xì)胞內(nèi)，培養(yǎng)上清 LDH活性極低。只有當(dāng)細(xì)胞膜受破壞，膜通透性增高，胞內(nèi)LDH釋放至細(xì)胞外，培養(yǎng)上清LDH活性才會(huì)升高，而活細(xì)胞無(wú)此功能，所以培養(yǎng)上清中LDH的含量可反映細(xì)胞的死亡或損傷程度。采用LDH法檢測(cè)槲皮素、茶多酚對(duì)PSD-007介導(dǎo)的PDT的影響，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，實(shí)驗(yàn)分組處理同“1.7”，每組4個(gè)復(fù)孔。各組放入CO2培養(yǎng)箱30 min后，吸去上清，每孔加入150 μL LDH釋放劑，搖晃均勻后孵育1 h。每孔吸取上清120 μL放入新孔中，并做好標(biāo)記。每孔再加入60 μL LDH檢測(cè)工作液，混勻后避光放置30 min。用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞LDH活性。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。

2 結(jié)果

2.1槲皮素和茶多酚對(duì)PC12細(xì)胞的毒性如Fig 1所示，6.25 μmol·L-1槲皮素使細(xì)胞存活率降低10.7%，50～100 μmol·L-1槲皮素使細(xì)胞存活率降

Fig 1 Cytotoxicity of quercetin and tea polyphenols on PC12 cells n=4 )

**P<0.01vscontrol

低約21.5%。茶多酚6.25～25 μmol·L-1組細(xì)胞存活率無(wú)明顯變化；茶多酚(25～100 μmol·L-1)隨濃度增加，細(xì)胞存活率降低，100 μmol·L-1茶多酚使細(xì)胞存活率降低了33.3%。

2.2PSD-007介導(dǎo)的PDT對(duì)PC12細(xì)胞的殺傷作用以4.8 J/cm2激光照射后，激光照射對(duì)照組細(xì)胞存活率100.4%，說(shuō)明4.8 J/cm2激光對(duì)細(xì)胞存活率沒(méi)有影響。如Fig 2所示，PSD-007(3.25～25 μmol·L-1)對(duì)PC12細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響，大于25 mg·L-1時(shí)PC12細(xì)胞的存活率開(kāi)始下降，50 mg·L-1時(shí)細(xì)胞存活率為90%。隨著PSD-007濃度的增加，PDT殺傷效應(yīng)增強(qiáng)，PC12細(xì)胞的存活率逐漸下降，在25 μmol·L-1濃度時(shí)趨于穩(wěn)定，細(xì)胞存活率為65%，不再有明顯降低?？傊?，光敏劑 PSD-007濃度低于25 mg·L-1時(shí)，幾乎沒(méi)有暗毒性，可以用于后續(xù)PDT實(shí)驗(yàn)。

Fig 2 Effects of PSD-007 and PSD-007 induced PDT on survival rates of PC12 n=4 )

**P<0.01vscontrol

2.3槲皮素和茶多酚對(duì)PSD-007PDT效應(yīng)的影響如Fig 3所示，PDT組細(xì)胞存活率為83.8%，槲皮素(12.5、25、50 μmol·L-1)組細(xì)胞存活率分別增加1.166倍、1.134倍、1.129倍。。槲皮素(12.5～50 μmol·L-1)對(duì)光動(dòng)力效應(yīng)具有拮抗作用，對(duì)PC12細(xì)胞具有保護(hù)作用；茶多酚(12.5、25、50 μmol·L-1)組細(xì)胞存活率降低14.0%、8.8%、17.2%，茶多酚(12.5～50 μmol·L-1)對(duì)PC12細(xì)胞不但沒(méi)有保護(hù)作用，反而抑制PC12細(xì)胞活性，茶多酚與光動(dòng)力效應(yīng)具有協(xié)同作用。

2.4槲皮素和茶多酚對(duì)PDT后LDH的影響如Fig 4A所示，與PDT組相比，槲皮素(12.5、25、50 μmol·L-1)組PC12細(xì)胞上清中LDH明顯降低(P<0.01)。如Fig 4B所示，與PDT組相比，茶多酚

Fig 3 Effects of quercetin(A) and tea polyphenols(B)

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsPDT

Fig 4 Effects of Que(A) and TP(B) on LDH in PC12 cell supernatant n=4)

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsPDT

(12.5、25、50 μmol·L-1)組PC12細(xì)胞上清中LDH無(wú)明顯變化(P>0.05)?？瞻讓?duì)照組、PSD-007組、LASER組PC12細(xì)胞上清中LDH活性很低。

3 討論

PDT基于細(xì)胞攝取光敏劑后，光敏劑經(jīng)合適波長(zhǎng)光激發(fā)后，可發(fā)生I型和II型光動(dòng)力反應(yīng)，產(chǎn)生活性氧。首先發(fā)生I型反應(yīng)，激發(fā)態(tài)的單線態(tài)氧直接損傷細(xì)胞膜或分子，通過(guò)質(zhì)子或電子傳遞，生成活性陰離子或陽(yáng)離子，繼續(xù)與氧和水反應(yīng)，生成自由基和活性氧。PDT產(chǎn)生的單線態(tài)氧等活性氧介導(dǎo)的氧化應(yīng)激，是PDT引起細(xì)胞損傷的主要細(xì)胞毒性劑。氧化應(yīng)激是由自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)面作用，被認(rèn)為是導(dǎo)致衰老和疾病的一個(gè)重要因素。在神經(jīng)退行性病變中有活性氧增加現(xiàn)象，抗氧化劑可以減緩氧化應(yīng)激帶來(lái)的危害。本文選擇使用光動(dòng)力療法對(duì)PC12細(xì)胞造成氧化損傷，建立一種檢測(cè)體內(nèi)藥物抗氧化能力的新方法，為抗氧化劑的新藥篩選建立一個(gè)新模型——PDT氧化應(yīng)激模型法，可用于高通量篩選的新藥藥效篩選模型。

據(jù)報(bào)道，γ射線、X射線電離輻射激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生大量自由基，槲皮素能減輕輻照后細(xì)胞內(nèi)氧化損傷，其濃度在 24 μmol·L-1時(shí)防護(hù)效果最佳[10-11]。槲皮素低濃度(<100 μmol·L-1)時(shí)對(duì)老年性黃斑變性人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的氧化性損傷具有保護(hù)作用[12]。PDT后產(chǎn)生氧自由基氧化損傷PC12細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素在6.25～50 μmol·L-1時(shí)， PC12細(xì)胞存活率約90%，抑制細(xì)胞增殖，槲皮素(50～100 μmol·L-1)表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。槲皮素(12.5～25 μmol·L-1)降低了PDT對(duì)PC12細(xì)胞的殺傷率，提高了PC12細(xì)胞的存活率，降低了上清LDH含量，說(shuō)明細(xì)胞膜是槲皮素保護(hù)作用的靶點(diǎn)，槲皮素12.5 μmol·L-1對(duì)細(xì)胞保護(hù)作用最佳。槲皮素具有抗癌作用，但對(duì)PDT效應(yīng)具有拮抗作用，具有雙向性，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]。

茶多酚是含有2個(gè)以上羥基的多酚類物質(zhì)，具有很強(qiáng)的供氫能力，可以終止自由基鏈反應(yīng)，因而被廣泛作為抗氧化劑應(yīng)用[8]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：茶多酚(6.25～25 μmol·L-1)組PC12細(xì)胞存活率沒(méi)有降低，茶多酚(25～100 μmol·L-1)隨濃度增加，細(xì)胞存活率逐漸降低，100 μmol·L-1時(shí)降低到70%，證明茶多酚具有抗腫瘤作用，與文獻(xiàn)報(bào)道[13]，茶多酚是一種具有很強(qiáng)生物學(xué)活性抗腫瘤藥物，已被證實(shí)對(duì)多種惡性腫瘤均有較強(qiáng)抵抗作用的結(jié)果一致。茶多酚抗癌機(jī)制為抑制致癌物前體的代謝活化，抑制腫瘤細(xì)胞DNA的復(fù)制，減少DNA損傷，阻斷AP-1信號(hào)通路等[4]。與PDT組相比，茶多酚+PDT組PC12細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.01)，12.5～50 μmol·L-1茶多酚對(duì)PDT損傷細(xì)胞膜幾乎沒(méi)有保護(hù)作用，與PDT對(duì)PC12細(xì)胞具有協(xié)同殺傷作用。

抗氧化劑對(duì)PDT氧化是否有保護(hù)作用，具有爭(zhēng)議。Frank等[14]發(fā)現(xiàn)，維生素C抑制5-ALA-PDT對(duì)癌細(xì)胞的氧化作用。Shevchuk等[15]發(fā)現(xiàn)，t-丁基-4-羥基茴香醚可以提高PDT的效率。Kelley等[16]證明，用抗氧化劑金絲桃素介導(dǎo)的PDT對(duì)HL-60細(xì)胞沒(méi)有明顯的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)用PSD-007誘導(dǎo)PDT氧化損傷PC12細(xì)胞，建立抗氧化藥物的細(xì)胞模型，可用于高通量藥物活性篩選，打破目前抗氧化實(shí)驗(yàn)只能在體外化學(xué)環(huán)境中進(jìn)行的局限性。初步篩選出天然抗氧化劑槲皮素對(duì)PSD-007損傷PC12細(xì)胞具有保護(hù)作用，茶多酚對(duì)PSD-007損傷PC12細(xì)胞具有協(xié)同作用(無(wú)保護(hù)作用)。除了細(xì)胞膜作用靶點(diǎn)外，其他作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。建立或完善天然抗氧化劑對(duì)光動(dòng)力效應(yīng)影響的數(shù)據(jù)庫(kù)，指導(dǎo)接受光動(dòng)力療法的病人的飲食，有待進(jìn)一步豐富資料。