郭凱敏 梁作文 田潤(rùn)輝 劉凌云*

1. 吉林大學(xué)第一醫(yī)院男科（長(zhǎng)春 130021）; 2. 吉林大學(xué)第一醫(yī)院心理衛(wèi)生科

不孕不育是一種威脅人類生殖健康的疾病，也是困擾世界醫(yī)學(xué)界的難題。據(jù)報(bào)道，全世界約10%～15%的夫妻患有不孕不育，其中男性因素約占30%～55%。近幾年，環(huán)境問(wèn)題尤其是環(huán)境對(duì)男性精子的影響越來(lái)越受到關(guān)注。配子生成素結(jié)合蛋白2（gametogenetin binding protein 2 ，GGNBP2），又稱鋅指蛋白403，于2001年由Ohbayashi首次報(bào)道[1]。 已有大量研究表明該蛋白表達(dá)與卵巢癌[2,3]、喉癌[4]、乳腺癌[5]、腦膠質(zhì)瘤[6]密切相關(guān)。該基因在睪丸組織中高表達(dá)，在精子發(fā)生中發(fā)揮重要作用。Chen報(bào)道GGNBP2缺失影響睪丸形態(tài)以及SOX-9支持細(xì)胞的功能[7]。我們前期研究也報(bào)道GGNBP2敲除引起雄性小鼠無(wú)精子癥，生精過(guò)程阻滯于精子細(xì)胞，生精上皮管腔完整性破壞，精子頂體畸形[8]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫熒光、免疫沉淀技術(shù)，探討GGNBP2與配子生成素（GGN）關(guān)系，以及Ggnbp2基因敲除對(duì)GGN mRNA和蛋白水平的影響及定位改變，從而初步揭示Ggnbp2基因缺失引起睪丸生精障礙的機(jī)制。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

Ggnbp2基因敲除小鼠先由C57BL/6雌性小鼠與野生型129/Sv雄性小鼠交配獲得雜合型，然后雜合型Ggnbp2小鼠交配最終獲得純合型敲除小鼠。動(dòng)物合格號(hào)：SCXK（京）2014-0013。配子生成素結(jié)合蛋白2抗體（GGNBP2）（美國(guó)Pacific Immuno.Corp）、配子生成素（GGN）抗體（美國(guó)Aviva System Biology）、β-Actin（美國(guó)Santa Cruz Biotech.公司）、二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠抗兔或山羊抗鼠IgG（美國(guó)Santa Cruz Biotech.公司）。SABC免疫組化試劑盒（武漢博士德公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（德國(guó)Binder公司）。敲除小鼠基因型鑒定PCR正向引物: 5’ AGTGCCATTTACCCACCAAG 3’ 反向:5’ GAAAGGAGGAGGGAAAGGAA 3’。CKX41-A32PH倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。低速離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）

二、免疫共沉淀檢測(cè)蛋白相互作用

睪丸組織蛋白濃度測(cè)定后，分裝3管，200μg蛋白量用于免疫沉淀，50μg蛋白加入1/3體積3×loading buffer 煮沸10min，用于Input。PBS清洗agarose A/G 珠子兩次，加入用于免疫沉淀的蛋白裂解液，加RIPA（含有蛋白酶抑制劑和磷酸化酶抑制劑）至200μL，再加入等體 2×沉淀緩沖液（100mmol/L Tris-HCl，300mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA，1%TritonX-100，pH 8.0），4℃沉淀1h。3 000×g離心，將上清液移至新管，1管加入1μg相應(yīng)抗體，另一管作為IgG對(duì)照，每管中分別加入20μL蛋白A/G 珠子，4℃旋轉(zhuǎn)過(guò)夜。次日用洗脫液A（50mmol/L Tris-HCl， 1mmol/L EDTA，0.5%TritonX-100, pH 8.0）洗滌珠子3次， 洗脫液B（10mmol/L Tris-HCl，0.1%TritonX-100 pH7.5）洗滌1次，低速離心，棄上清，加入40μL RIPA與1/3體積3×loading buffer混合，100℃煮沸10min，離心后，加入20μL上樣到SDS-PAGE膠，進(jìn)行電泳，剩余-20℃保存。

三、睪丸生精細(xì)胞的分離

取睪丸組織，置于室溫1×KREBS 液，剔除附睪、輸精管、睪丸白膜后，置于50mL 管中，加入濃度為1mg/mL膠原酶5mL和2mg/mL胰蛋白酶，置于33℃溫水浴孵育，靜置5min，棄上清，加入3μL DNAse，100μm過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾，取細(xì)胞懸液顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，可見(jiàn)分散的睪丸各級(jí)生精細(xì)胞。PBS洗滌兩次，用于后續(xù)檢測(cè)。

四、RT-PCR 檢測(cè)基因表達(dá)

應(yīng)用T R I z o l試劑盒（按說(shuō)明書(shū)操作）提取睪丸組織分離的生精細(xì)胞R N A，進(jìn)行R T-P C R檢測(cè)。設(shè)計(jì)G G N 正向引物：5’GGCTGAGATAATATTGGAGGACAG 3’ ，反向引物：5’ GAAGAGCCCGTGGGTTT 3’ 。引物由上海生工技術(shù)服務(wù)公司合成。PCR反應(yīng)條件：95℃、3min，94℃、40s；57℃、50s，72℃、1min，30個(gè)循環(huán)；72℃、7min。PCR產(chǎn)物相對(duì)表達(dá)水平=靶基因相對(duì)灰度值/ β-Actin，蛋白相對(duì)表達(dá)水平=靶蛋白相對(duì)灰度值/ β-Actin。

五、免疫印跡檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)

取新鮮睪丸組織，去白膜后，加入適量RIPA細(xì)胞裂解液Brandford，組織勻漿器冰上操作20s，超聲波粉碎儀裂解處理10s后，4℃高速12 000×g離心15min；Brandford蛋白定量后SDS-PAGE電泳，電壓120v，PVDF濕轉(zhuǎn)（電壓150v，120min），5%脫脂牛奶封閉1h，一抗4℃孵育過(guò)夜，次日TBS-T洗膜3次，每次5min，相應(yīng)二抗室溫孵育1h。X片暗室曝光，計(jì)算機(jī)掃描條帶，并與β-Actin條帶進(jìn)行對(duì)比分析獲得各自相對(duì)表達(dá)水平。

六、精母細(xì)胞染色體分散實(shí)驗(yàn)和免疫熒光、免疫組化檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)方法依照Kobayashi報(bào)道[9]。 取30d小鼠睪丸組織，剔除白膜后，低滲緩沖液（30mmol/L Tris-Base，50mmol/L蔗糖 ，17mmol/L 二水枸櫞酸三鈉，5mmol/L EDTA，0.5mmol/L DTT，0.5mmol/L PMSF ，pH8.2），室溫作用30～60min。滴100mmol/L蔗糖溶液于載玻片，取少許睪丸組織置于其上，組織剪剪碎至小塊，用蓋玻片左右推片3～4次，將1%PFA溶液滴于覆蓋的玻片上，濕盒固定1h，使用前PBS洗1～2次。10%donkey 血清室溫封閉1h，用待檢測(cè)抗體4℃孵育過(guò)夜。次日分別加入含有熒光的二抗，避光孵育1h，DAPI復(fù)染，熒光顯微鏡觀察。肉眼計(jì)數(shù)免疫染色Foci改變。

成年雄性小鼠睪丸經(jīng)脫水、固定、石蠟包埋后切片，經(jīng)脫蠟、過(guò)氧化氫滅活、高溫抗原修復(fù)處理、4%羊血清封閉后，加入一抗4℃過(guò)夜。次日加入相應(yīng)二抗孵育，DAB 顯色和復(fù)染，在蘇木素染色液中復(fù)染 30～60 s，經(jīng)梯度酒精脫水、透明，封片保存。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行分析。所有計(jì)量資料均符合正態(tài)分布。組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

一、GGNBP2與GGN相互作用

采用野生型成年小鼠睪丸組織蛋白200μg，行免疫沉淀，結(jié)果提示GGN能夠沉淀GGNBP2，同時(shí)GGNBP2也能夠沉淀GGN，提示GGNBP2與GGN相互作用，見(jiàn)圖1。

二、GGNBP2與GGN在精母細(xì)胞和精子細(xì)胞的定位。

分離60d野生型小鼠睪丸生精細(xì)胞，應(yīng)用免疫熒光觀察精母細(xì)胞和精子細(xì)胞4個(gè)期間（Golgi, Cap, Acrosome和Maturation phases）GGNBP2與GGN的表達(dá)定位，DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，結(jié)果顯示GGNBP2與GGN均定位于精母細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞漿，且在精子細(xì)胞 高爾基體期（Golgi）和 頭帽期（Cap ） 定位于細(xì)胞核和細(xì)胞漿，而頂體期（Acrosome ）定位于胞漿和頂體，最后在成熟期（Maturation）表達(dá)于精子尾部（圖2）。

圖1 免疫共沉淀檢測(cè) GGNBP2與GGN相互作用

圖2 免疫熒光檢測(cè)GGNBP2 與GGN在精母細(xì)胞以及精子細(xì)胞4個(gè)期的共定位

三、Ggnbp2基因敲除對(duì)Ggn 基因 和蛋白表達(dá)以及定位的影響

分離30d和60d野生型和Ggnbp2KO小鼠睪丸生精細(xì)胞，PCR和Western blot結(jié)果提示Ggnbp2基因敲除小鼠生精細(xì)胞mRNA和蛋白表達(dá)均下降，且有顯著性差異（圖3）。

免疫組化結(jié)果提示GGN高表達(dá)于睪丸組織生精小管精母細(xì)胞核、精子細(xì)胞以及成熟精子的細(xì)胞核和細(xì)胞漿，而在Ggnbp2基因敲除睪丸生精小管，可見(jiàn)精子細(xì)胞數(shù)量明顯減少，而GGN主要表達(dá)于精母細(xì)胞細(xì)胞核（圖4）。

同時(shí)染色體細(xì)胞核分散免疫熒光進(jìn)一步提示Ggnbp2基因敲除引起GGN表達(dá)局限于細(xì)胞核，胞漿染色熒光強(qiáng)度顯著減弱（圖5）。

圖3 Ggnbp2基因敲除對(duì)GGN基因和蛋白水平的影響

圖4 免疫組化檢測(cè)GGN在兩組睪丸生精小管中表達(dá)（×100）

討 論

GGNBP2，又被稱為DIF-3 或ZNF403，是鋅指蛋白家族進(jìn)化過(guò)程中的一種保守蛋白，在睪丸中的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于其他組織，其生理功能與生殖過(guò)程密切相關(guān)。GGNBP2作為配子生成素（Ggn）的結(jié)合蛋白，后者是小鼠生殖細(xì)胞特異基因，其可變剪接產(chǎn)物配子生成素蛋白1（GGN1）、蛋白2（GGN2）和蛋白3（GGN3）在生殖細(xì)胞特定發(fā)育階段的特異性表達(dá)[10]。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)GGNBP2 能夠與GGN1、GGNBP1以及OAZ3 相互作用，在精子發(fā)生過(guò)程中起決定作用[10,11]。我們用免疫沉淀進(jìn)一步證實(shí)GGNBP2與GGN相互作用，形成蛋白復(fù)合體，參與精子發(fā)生。

既然 GGNBP2與GGN都高表達(dá)于睪丸組織，其在生精過(guò)程中定位情況如何。Jamsai等[12]研究發(fā)現(xiàn)GGN1蛋白表達(dá)最早出現(xiàn)在減數(shù)分裂粗線期精母細(xì)胞，并在圓精子細(xì)胞中高表達(dá)，其富含158個(gè)氨基酸序列的羧基結(jié)構(gòu)域可與富含半胱氨酸的分泌蛋2（CRISP2）的離子通道調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合，共表達(dá)于精子尾部，提示可能精子的活動(dòng)。Lu等更加明確了GGN的3個(gè)剪切體分別定位于核膜、胞漿和細(xì)胞核[10,13]。我們采用免疫熒光，觀察精母細(xì)胞以及精子細(xì)胞4個(gè)期（Golgi, Cap, Acrosome和Maturation phases）GGNBP2與GGN的定位改變，發(fā)現(xiàn)GGNBP2與GGN在精母細(xì)胞和精子細(xì)胞中定位完全吻合，且在精子細(xì)胞 Golgi和Cap 期 定位于細(xì)胞核和細(xì)胞漿，而Acrosome 期定位于胞漿和頂體，最后在Maturation期表達(dá)于精子尾部，這一發(fā)現(xiàn)也進(jìn)一步提示GGNBP2與GGN一樣，同時(shí)參與精子的活動(dòng)。此外，Jamsai等在他的另一項(xiàng)研究中報(bào)道了[14]GGN完全缺失引起胚胎移植前死亡，沒(méi)有存活囊，而Ggn雜合型敲除小鼠能存活，DNA雙鏈損傷修復(fù)受損，以此推測(cè)GGNBP2可能也參與DNA雙鏈損傷修復(fù)。

圖5 免疫熒光檢測(cè)Ggnbp2基因敲除對(duì)GGN在精母細(xì)胞定位變化

研究顯示小鼠POG蛋白（proliferation of germ cells）缺失引起原始生殖細(xì)胞缺陷，導(dǎo)致小鼠生精異常，精母細(xì)胞和精子細(xì)胞數(shù)量顯著低于正常[15]。而GGN能與POG蛋白相互作用，調(diào)控POG 蛋白定位[10]，在精子發(fā)生中起重要作用。基于上述研究，我們用Ggnbp2基因敲除動(dòng)物模型，驗(yàn)證基因缺失對(duì)GGN的mRNA和蛋白、以及細(xì)胞定位的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ggnbp2基因敲除能顯著降低GGN mRNA和蛋白水平，在未成年和成年小鼠均有抑制作用。我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GGNBP2 mRNA水平在小鼠出生后14d開(kāi)始升高，直到性成熟期都保持較高的水平，而且mRNA在精母細(xì)胞和精子細(xì)胞高表達(dá)，睪丸支持細(xì)胞低表達(dá)。而GGNBP2蛋白在精母細(xì)胞、精子細(xì)胞以及成熟精子均表達(dá)[8]。GGN免疫組化結(jié)果也證實(shí)GGN同GGNBP2定位一致，在精母細(xì)胞和精子細(xì)胞、成熟精子高表達(dá)，且主要表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞漿。Ggnbp2基因敲除，GGN主要定位于細(xì)胞核。染色體細(xì)胞核分散結(jié)合免疫熒光進(jìn)一步證實(shí)Ggnbp2基因敲除引起GGN在精母粗線期、雙線期、終變期主要集中在細(xì)胞核，而且熒光強(qiáng)度明顯減弱。從而我們推測(cè)，Ggnbp2基因敲除引起小鼠生精功能缺陷主要通過(guò)降低GGN表達(dá)，改變GGN細(xì)胞定位， DNA雙鏈損傷修復(fù)機(jī)制受損而引起。

我們下一步將圍繞GGNBP2如何引起DNA雙鏈損傷修復(fù)受損以及涉及的一些重要DNA損傷修復(fù)蛋白進(jìn)行深入研究，進(jìn)而揭示其導(dǎo)致生精功能障礙的機(jī)制。