陳 誠 張學(xué)軍

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院整形外科 上海 200032)

黑色素瘤是一種惡性程度極高的腫瘤,目前尚無有效的藥物治療手段[1]。黑色素瘤侵襲性很強(qiáng)[2],細(xì)胞和分子機(jī)制仍未完全闡明[3]。黑色素瘤具有缺乏血供和高增殖特性,極易因微環(huán)境的改變而出現(xiàn)應(yīng)激,如低氧、營養(yǎng)缺乏和酸堿度改變。這些應(yīng)激將導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)大量蛋白質(zhì)的折疊和修飾出現(xiàn)錯(cuò)誤,致使這些蛋白質(zhì)沉積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔內(nèi),導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,進(jìn)而誘發(fā)未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)[4-6]。UPR又反饋性使細(xì)胞大量合成蛋白質(zhì)(以分泌型蛋白質(zhì)為主),重建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。因此,UPR與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密不可分。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞體內(nèi)存在3種UPR途徑,分別由活化因子6 (activating factor 6,ATF6)、肌醇酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)和雙鏈RNA激活的蛋白激酶樣ER激酶(double-stranded RNA-activated protein kinase-like ER kinase,ERPERK)介導(dǎo)。其中IRE1途徑是3種URP途徑中進(jìn)化最保守的。IRE1是雙官能團(tuán)單跨膜蛋白質(zhì),包括管腔區(qū)域,連接區(qū)域,激酶區(qū)和核糖核酸內(nèi)切酶區(qū)。其中管腔區(qū)域存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔,能夠感受未折疊蛋白質(zhì)的堆積,激活感受器。激酶和內(nèi)切酶區(qū)激活后,可以非傳統(tǒng)方式剪接下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子XBP1(X-box binding protein 1)的26 nt內(nèi)含子片段,使之發(fā)生框架移碼,轉(zhuǎn)錄出具有活性的XBP1s[7]。

大量的研究已表明UPR可在多種實(shí)體腫瘤中被激活[8-9]。但I(xiàn)RE1-XBP1通路在黑色素瘤中的表達(dá)和作用尚不明確,本研究擬通過臨床樣本及體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)闡明IRE1-XBP1信號(hào)通路在黑色素瘤細(xì)胞增殖中的作用。

資 料 和 方 法

患者信息收集2015年3月至2016年12月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院收治的、經(jīng)病理檢查明確的黑色素瘤患者61例,平均年齡為57.9歲(30～85歲),其中男性36例,女性25例,原發(fā)灶部位為頭面部的3例,軀干部12例,四肢46例,所有患者均無淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

細(xì)胞培養(yǎng)黑色素細(xì)胞系(HEMn-MP和HEMn-DP)和黑色素瘤細(xì)胞系(Mel-RMu、MM200、Mel-CV、IgR3、A2058和SkMel-28)均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。培養(yǎng)體系采用DMEM高糖培養(yǎng)基加10%胎牛血清(Gibco,美國Thermo Fisher公司)。

細(xì)胞增殖檢測(cè)96孔板鋪板,每孔1×103個(gè)細(xì)胞與CCK8試劑在37 ℃孵育,不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)450 nm處的熒光強(qiáng)度。采用BrdU檢測(cè)試劑盒(編號(hào)6813,美國Cell Signaling公司),按照說明書進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)。

免疫組化4%甲醛水溶液包被的組織切片行免疫組化染色,檢測(cè)XBP1s (1∶100,美國BioLegend公司)表達(dá)。用ImagePro Plus 6.0 (美國Media Cybernetics公司)檢測(cè)直徑1 mm的圓柱體區(qū)域中積分吸光度來反映XBP1s的表達(dá)強(qiáng)度。通過計(jì)算積分吸光度與總面積的乘積來代表XBP1s平均密度。

RT-PCRTrizol法(美國Invitrogen公司)提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后,通過SYBR Green法(瑞士Roche公司)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系(20μL):SYBR Premix Ex Taq 10μL,上下游引物各1μL,cDNA模版2μL,ddH2O 6μL。反應(yīng)條件:95 ℃,30 s;95 ℃,5 s;58 ℃,30 s;72 ℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。

Westernblot將細(xì)胞裂解,提取組織蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,于10%脫脂奶/TBST中封閉,加入抗人IRE1α抗體(1∶1 000,美國Cell Signaling 公司);抗人XBP1s抗體(1∶500,美國BioLegend公司)或抗人GAPDH抗體(1∶5 000,英國Abcam公司),4 ℃過夜,加入二抗,顯色。

結(jié) 果

XBP1s在人黑色素瘤組織中的表達(dá)對(duì)61對(duì)黑色素瘤及瘤旁正常組織行XBP1s免疫組化檢測(cè)(圖1A),發(fā)現(xiàn)XBP1s在黑色素瘤組織中顯著高表達(dá),主要位于細(xì)胞核,細(xì)胞質(zhì)中也有部分表達(dá)(圖1B)。進(jìn)一步檢測(cè)XBP1s的mRNA水平,發(fā)現(xiàn)XBP1s的mRNA水平在黑色素瘤中亦顯著升高(圖1C),提示IRE1α-XBP1信號(hào)通路在黑色素瘤中處于激活狀態(tài)。

Representative images (A) and integrated optical density (IOD) (B) analysis of the immunohistochemical images of melanoma tissues and paired normal skin tissues from 61 melanoma patients.XBP1s level was analyzed by real-time PCR in both melanoma tissues and normal skin tissues (C).

圖1人黑色素瘤細(xì)胞中XBP1s的表達(dá)
Fig1ExpressionofXBP1sinhumanmelanomasamples

在正常黑色素細(xì)胞及黑色素瘤細(xì)胞中XBP1s水平的比較為了進(jìn)一步證實(shí)XBP1s在黑色素瘤中的高表達(dá),我們分別在2種正常黑色素細(xì)胞系(HEMn-MP和HEMn-DP)和6種黑色素瘤細(xì)胞系(Mel-RMu、MM200、Mel-CV、IgR3、A2058和SkMel-28)中檢測(cè)了XBP1s的mRNA水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),剪接片段XBP1s的mRNA水平在所有黑色素瘤細(xì)胞系中相較正常黑色素細(xì)胞均顯著上升(P<0.05,圖2)。

Melanocytes:HEMn-MP and HEMn-DP;Melanoma cells:Mel-RMu,MM200,Mel-CV,IgR3,A2058 and SkMel-28.

圖2黑色素細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞中XBP1s/XBP1t的mRNA水平
Fig2ThemRNAlevelofXBP1s/XBP1tinmelanocytesandmelanomacells

IRE1α-XBP1信號(hào)通路調(diào)控IL-6表達(dá)為了探究XBP1下游是否調(diào)控炎癥因子IL-6的表達(dá),我們分別在正常黑色素細(xì)胞系HEMn-MP和黑色素瘤細(xì)胞系Mel-RMu中過表達(dá)XBP1s。結(jié)果表明,IL-6 mRNA水平在HEMn-MP細(xì)胞(圖3A)和Mel-RMu(圖3B)中顯著上升。接下來,我們擬闡明,調(diào)控XBP1剪接的重要蛋白質(zhì)IRE1α是否參與IL-6的調(diào)控。通過轉(zhuǎn)染pCMV-IRE1α質(zhì)粒,使HEMn-MP和Mel-RMu細(xì)胞系分別過表達(dá)IRE1α(圖3C)。IRE1α在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的過度堆積導(dǎo)致自身磷酸化,激活其RNA酶活性,從而剪接XBP1。因此,HEMn-MP和Mel-RMu細(xì)胞系分別過表達(dá)IRE1α后,XBP1s mRNA水平顯著上升,使用針對(duì)IRE1α的RNA酶活性抑制劑4μ8C后,可顯著抑制XBP1s的轉(zhuǎn)錄水平(圖3D),證實(shí)IRE1α在黑色素細(xì)胞中調(diào)控下游XBP1的表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證IRE1α-XBP1通路調(diào)控IL-6表達(dá),我們?cè)谶^表達(dá)IRE1α 的HEMn-MP和Mel-RMu細(xì)胞系中檢測(cè)IL-6的mRNA水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),過表達(dá)IRE1α后IL-6水平顯著上升,阻斷IRE1α的RNA酶活性后可使IL-6水平下降至接近基線水平(圖3E),提示IRE1α-XBP1信號(hào)通路可調(diào)控IL-6表達(dá)。

IRE1α-XBP1-IL-6信號(hào)通路促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖大量的研究表明IL-6信號(hào)能促進(jìn)細(xì)胞增殖[10],因此我們?cè)O(shè)想IRE1α-XBP1也能通過IL-6突進(jìn)促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖。我們用CCK8和BrdU方法檢測(cè)了黑色素瘤細(xì)胞系Mel-RMu的細(xì)胞增殖。結(jié)果表明,過表達(dá)IRE1α后,細(xì)胞增殖顯著上升,此效應(yīng)可被IL-6中和抗體所阻斷,表明分泌型IL-6發(fā)揮了重要作用(圖4A和B)。過表達(dá)XBP1s后,可觀察到同樣的現(xiàn)象(圖4C和D),提示IRE1α-XBP1-IL-6信號(hào)通路促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖。

A:mRNA levels of XBP1s and IL-6 as determined by real-time PCR in HEMn-MP;B:Mel-RMu cells transfected with plasmids pCMV-XBP1s (XBP1s) or pCMV (Ctrl.);C:The IRE1α protein levels were determined by immunoblotting in both HEMn-MP and Mel-RMu cells transfected with plasmids pCMV-IRE1α (IRE1) or pCMV (Ctrl.).XBP1 splicing (D) and (E) IL-6 expression levels were determined by real-time PCR in IRE1α-overexpressing HEMn-MP and Mel-RMu cells with 4μ8C treatment.(1)P< 0.05,(2)P< 0.01.

圖3IRE1α-XBP1通路調(diào)控IL-6表達(dá)
Fig3TheIRE1α-XBP1pathwayregulatesIL-6expression

討 論

盡管UPR途徑在黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,但其具體機(jī)制仍未闡明。本研究揭示了IRE1α依賴的XBP1s途徑通過上調(diào)IL-6信號(hào)分泌IL-6促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖。

XBP1s作為IRE1α的間接產(chǎn)物,是一種重要的反式作用因子,可調(diào)控大量的基因表達(dá),從而緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。除了在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的重要作用[11],IRE1α-XBP1通路還參與調(diào)節(jié)很多生理性途徑,如PPARα(peroxisome proliferator-activated receptor alpha)[12]和Fasn(fatty acid synthase)[13]等。此外,IRE1α-XBP1通路還具有非轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能,如促進(jìn)FoxO1(forkhead box O1)蛋白質(zhì)的降解[14];在巨噬細(xì)胞中,XBP1s能與IL-6基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合,促進(jìn)IL-6的轉(zhuǎn)錄[15],但其在黑色素瘤中的作用機(jī)制尚不明確。我們研究發(fā)現(xiàn)使用針對(duì)IRE1α的RNA酶活性抑制劑4μ8C后,可顯著抑制XBP1s的轉(zhuǎn)錄水平,同時(shí)降低IL-6的表達(dá),而IL-6對(duì)細(xì)胞的增殖起關(guān)鍵作用,因此我們認(rèn)為IRE1α RNA酶的活性是研究黑色素瘤治療的新靶標(biāo)。

有學(xué)者報(bào)道IRE1α可以通過調(diào)節(jié)STAT3信號(hào)通路促進(jìn)肝細(xì)胞增殖和肝臟再生[16],且已經(jīng)證明IRE1α與胰島細(xì)胞的增殖[17]及一些腫瘤細(xì)胞的增殖[18]相關(guān),但I(xiàn)RE1α-XBP1信號(hào)通路是否與黑素瘤細(xì)胞的生長有關(guān)尚不明確。我們的研究證實(shí)了IRE1α-XBP1s在促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞增殖中起到關(guān)鍵作用,無論是過表達(dá)IRE1α還是XBP1s,IL-6的轉(zhuǎn)錄活性均明顯升高,且黑色素瘤的增殖顯著上升,若在培養(yǎng)體系中加入IL-6抗體,則可抑制過表達(dá)IRE1α和XBP1s所帶來的促瘤效應(yīng)。綜上所述,我們認(rèn)為URP途徑中的IRE1α-XBP1s信號(hào)通路通過促進(jìn)IL-6的轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)了黑色素瘤細(xì)胞的增殖,且最終效應(yīng)是由分泌的IL-6所致。本研究為黑色素瘤的防治提供了新的思路,也為將來的藥物開發(fā)提供了新靶點(diǎn)。

A:Cell proliferation was analyzed by CCK8 assay and BrdU assay in Mel-RMu cells transfected with plasmids pCMV-IRE1α (IRE1) or pCMV (Ctrl.) and treated with anti-IL-6 antibodies;B:Cell proliferation were analyzed by CCK8 assay and BrdU assay in Mel-RMu cells transfected with plasmids pCMV-XBP1 (IRE1) or pCMV (Ctrl.) and treated with anti-IL-6 antibodies.(1)vs.Ctrl.group (Student’sttest,one-way or two-way ANOVA),P<0.05;(2)vs.IRE1+anti-IL-6 or XBP1s + anti-IL-6 groups (Student’sttest),P<0.05.

圖4IRE1α-XBP1-IL-6信號(hào)通路促進(jìn)Mel-RMu細(xì)胞的增殖
Fig4IRE1α-XBP1-IL-6pathwaypromotesmelanomacellproliferation