于 鑫 張永鎮(zhèn) 于恩達 王 娜 帥 群 閆飛虎 蔣露芳王和興 劉健翔 陳 躍 李兆申 蔡全才△ 姜慶五

(1復旦大學公共衛(wèi)生學院流行病學教研室-教育部公共衛(wèi)生安全重點實驗室,5營養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室-教育部公共衛(wèi)生安全重點實驗室 上海 200032; 2海軍軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院消化內科,6普外科 上海 200433; 3中國人民解放軍92914部隊醫(yī)院消化內科 臨高 571833;4渥太華大學醫(yī)學系流行病與公共衛(wèi)生學院 渥太華 K1G 5Z3)

結直腸癌是常見的消化道腫瘤之一,2013年中國結直腸癌發(fā)病人數(shù)居惡性腫瘤第4位,新發(fā)病例數(shù)約34.8萬人,死亡人數(shù)約16.5萬人[1]。隨著人口老齡化、社會經(jīng)濟發(fā)展及生活方式改變等一系列原因,我國的結直腸癌發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢[2]。

結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展與遺傳和環(huán)境因素有關。85%～95%的病例以各種環(huán)境因素為病因,包括西方模式的飲食習慣、吸煙、飲酒、肥胖以及糖尿病等[3]。近年來,腸道菌群改變以及促腫瘤微環(huán)境的形成在結直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用日益受到關注[4-5]。

主流觀點認為,大部分結直腸癌的發(fā)展經(jīng)歷了正常上皮細胞—腺瘤—進展期腺瘤—腫瘤的一系列過程[4]。已有動物實驗證據(jù)表明特定細菌(如具核梭桿菌)與結直腸腫瘤的形成密切相關[6],然而關于良性的增生性息肉與腺瘤和作為癌前病變的進展期腺瘤的菌群變化特征研究較少,樣本量也較小。本研究基于單中心病例對照研究,分析結直腸癌早期病變(癌前病變與良性病變)患者的腸道菌群變化特征,探索在結直腸癌早期病變中可能發(fā)揮重要作用的細菌,為腸道菌群變化與結直腸癌早期階段的關系提供線索。

資 料 和 方 法

研究對象本研究為病例對照研究,研究對象來自2014—2015年海軍軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院門診的腸鏡受檢者。共納入研究對象280例,包括88例進展期腺瘤患者、32例單純腺瘤患者、30例增生性息肉患者以及130位無結直腸疾病的受檢者。將進展期腺瘤患者納入癌前病變組;將單純腺瘤患者與增生性息肉患者納入良性病變組;將無結直腸疾病的受檢者納入對照組。

病例組研究對象納入標準:(1)患者在長海醫(yī)院初次被診斷為相應疾病;(2)年齡≥40歲;(3)漢族;(4)檢查前無腸道腫瘤、息肉、炎性腸病,無結直腸腫瘤家族史,無其他器官腫瘤病史和腸道相關手術史;(5)過去6個月未使用過抗生素;(6)能同時獲得治療前糞便標本并填寫調查問卷表;(7)對參加本課題研究知情同意。對照組經(jīng)結腸鏡檢查無結直腸相關疾病,其余納入標準與病例組一致。本項研究通過海軍軍醫(yī)大學倫理委員會審核(編號:CHEC2015-082)。

樣本收集與處理所有研究對象均完成一份調查問卷,包括年齡、性別、體重指數(shù)(body mass index,BMI)、生活習慣(包括吸煙、飲酒)、疾病既往史等。BMI≥24 kg/m2為超重,BMI≥28 kg/m2為肥胖[7]。位于盲腸、升結腸、肝曲、橫結腸、脾曲的病變?yōu)榻瞬∽?而位于降結腸、乙狀結腸與直腸為遠端病變。進展期腺瘤指直徑超過1cm的腺瘤、絨毛狀腺瘤或伴有重度不典型增生的管狀腺瘤。吸煙、飲酒情況按照從無或曾經(jīng)有過進行分類。

所有研究對象的新鮮糞便樣本(≥1 g)于結直腸鏡檢腸道準備之前取得。糞便樣本細菌的DNA使用OMEGA-soil DNA試劑盒(美國Omega Bio-Tek公司)按照說明書進行提取。經(jīng)過PCR擴增之后,對細菌的16S rDNA的V3～V4片段進行測序,使用通用引物338F 5’-ACTCCTACGGGAGG-CAGCAG-3’與806R 5’-GGACTACHVGGGTW-TCTAAT-3’。測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司在Illumina MiSeq平臺完成。

生物信息學分析與統(tǒng)計分析采用 Trimmomatic軟件篩除序列尾部質量值20以下的堿基,過濾50 bp窗口內平均質量低于20的窗口以及尾部,篩除單條序列,在此基礎上以97%相似度聚類得到操作分類單元(operational taxonomic units,OTU),挑選出每個OTU的代表序列并利用SINTAX算法[8]與RDP數(shù)據(jù)庫對比得到每個OTU的群落名稱。參數(shù)設置:對門、綱、目、科、屬級別的置信閾值為0.8,對種級別的置信閾值為0.5。

為比較不同組的研究對象腸道菌群物種多樣性,基于OTU表格計算α多樣性(ace,shannon,simpson,PD whole tree)與β多樣性(非加權和加權Unifrac距離),并對3組研究對象的α多樣性進行方差分析。為衡量總體的菌群結構差異,基于β多樣性進行PERMANOVA分析,同時控制潛在的混雜因素,包括年齡、性別、BMI、吸煙及飲酒情況。

為比較3組研究對象在屬與種兩個分類級別上的差別,使用懷特非參數(shù)檢驗[9](White’s non-parametrict-test)挑選出差異細菌并進行可視化,多重比較校正采用Benjamini-Hochberg方法。生物信息分析利用QIIME 1.9.1平臺完成,統(tǒng)計分析使用R軟件v 3.3.2完成,不同組間細菌豐富度差異的檢驗應用STAMP v 2.1.3軟件。

結 果

研究對象的一般情況研究對象的年齡為40～84歲,癌前病變組、良性病變組和對照組在性別、年齡、BMI和病變位置方面的差異均無統(tǒng)計學意義,癌前病變組與良性病變組相比,病變部位更多位于遠端(χ2=4.84,P=0.028)。

表1 結直腸腺瘤與息肉患者及對照組的一般情況Tab 1 Distribution of basic information among patients with and without colorectal adenoma and polyps

aPvalues were calculated byχ2test;bPvalue was calculated by ANOVA;A-CRA:Advanced colorectal adenoma;Polyps:Colorectal adenoma and hyperplastic polyps.

腸道菌群總體描述經(jīng)過質量控制與清洗,最終在280個樣本中得到19 714 595條高質量序列,1 512個OTU。根據(jù)物種分類可以分為12個門,19個綱,29個目,57個科,119個屬,238個種(納入條件:門平均相對豐富度> 0.01%;綱至種:相對豐富度>0.001%)。

三組樣本的α多樣性無統(tǒng)計學差異(ace:F=2.293,P=0.103;shannon:F=0.079,P=0.924;simpson:F=0.181,P=0.835;PD whole tree:F=1.540,P=0.216;方差分析)。在控制了年齡、性別、BMI以及吸煙飲酒情況之后,基于β多樣性距離進行PERMANOVA分析發(fā)現(xiàn),不同組的腸道菌群結構有統(tǒng)計學差異(非加權Unifrac 距離:F=1.834,P=0.005;加權 Unifrac 距離:F=0.725,P=0.626)。

癌前病變組、良性病變組與對照組在“屬”分類級別的比較通過對119個菌屬進行非參數(shù)檢驗,結果顯示共有7個菌屬在早期病變患者體內有顯著變化。與對照組相比,癌前病變組患者體內的卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)(P<0.001)與Alloprevotella(P<0.001)明顯上升,而雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)顯著下降(P=0.018);良性病變組患者Akkermansia(P=0.007)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)(P<0.001)和乳酸桿菌屬(Lactobacillus)(P<0.049)顯著增多,而克雷伯氏菌屬(Klebsiella)(P<0.001)和雙歧桿菌屬(P<0.001)顯著減少(圖1)。

(1)polypsvs.control,(2)A-CRAvs.control,P<0.05.

圖1結直腸腺瘤與息肉患者與對照組相比在“屬”級別細菌變化情況
Fig1Featuredmicrobesinthecomparisonbetweencontrolsandpatientswithcolorectaladenomaandpolypsatthegenuslevel

癌前病變組、良性病變組與對照組在“種”分類級別的比較對238個菌種進行非參數(shù)檢驗,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,癌前病變組患者糞便中有11個菌種存在顯著差別(圖2),其中Clostridiumbolteae(P=0.014)、Alloprevotellarava(P<0.001)、Enterobactersoli(P<0.001)、牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)(P<0.001)共4種細菌顯著上升,而丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)(P=0.001)、Veillonelladispar(P<0.001)、Veillonellarogosae(P=0.005)、Fusobacteriummortiferum(P<0.001)、Bacteroidescoprophilus(P=0.026)、Clostridiumcolinum(P=0.030)與Streptococcusdentisani(P=0.028)共7種細菌中顯著下降。

與對照組相比,良性病變組患者糞便內發(fā)現(xiàn)副流感嗜血桿菌(Haemophilusparainfluenzae)(P<0.001)、Prevotellastercorea(P=0.011)、Clostridiumbolteae(P=0.006)、Enterobactersoli(P<0.001)、Akkermansiamuciniphila(P=0.006)、Veillonellaatypica(P<0.001)、Veillonellaratti(P=0.007)共7種細菌顯著上升,而Veillonelladispar(P<0.001)、Megasphaeraindica(P=0.014)、Clostridiumcolinum(P=0.027)和Clostridiumbutyricum(P=0.007)共4種細菌顯著下降(圖2)。

討 論

本研究通過以醫(yī)院資料為基礎的病例對照研究,對首次診斷的進展期腺瘤、單純腺瘤和增生性息肉患者腸道菌群構成變化進行了分析。

近年來,關于腸道菌群的變化與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展關系的重要研究不斷增多[4-5,10]。本研究比較進展期腺瘤患者與對照組的糞便菌群發(fā)現(xiàn),卟啉單胞菌屬以及其菌種牙齦卟啉單胞菌、Alloprevotella以及其菌種Alloprevotellarava在進展期腺瘤患者糞便中明顯上升。牙齦卟啉單胞菌是一種能引起牙周疾病的厭氧致病菌,與口腔癌的發(fā)生密切相關。流行病學研究發(fā)現(xiàn)[11],牙周病以及牙齒牙列缺失可能增加結直腸癌的發(fā)生風險。有研究指出[12],卟啉單胞菌屬、消化鏈球菌(Peptostreptococcus)等引起牙周疾病的致病菌在結直腸癌患者腸道菌群中有顯著上升,猜測牙周致病菌同時是結直腸癌潛在致病菌,牙齦卟啉單胞菌等致病菌對結直腸癌的致病模式可能與牙周病類似。提示牙周病致病菌對結直腸癌可能有重要作用。關于Alloprevotellarava的研究較少,有文獻指出其與白塞病可能有關[13]。

(1)Polypsvs. control,(2)A-CRAvs. control,P<0.05.

圖2結直腸腺瘤與息肉患者與對照組相比在“種”級別細菌變化情況
Fig2Featuredmicrobesinthecomparisonbetweencontrolsandpatientswithcolorectaladenomaandpolypsatthespecieslevel

雙歧桿菌屬是人體腸道內重要的常見共生細菌。該菌屬下的一些菌種被認為是能對機體產(chǎn)生有利影響的益生菌[14]。既往研究中指出,在結直腸癌患者糞便中以及腸道黏膜附著的雙歧桿菌屬豐富度明顯下降,提示其可能在結直腸癌進展過程中發(fā)揮預防與保護的作用[15-16]。雙歧桿菌能發(fā)揮抗過敏效應、減少有害細菌等多種生理作用[17]。在本研究中,進展期腺瘤患者體內雙歧桿菌屬較對照組顯著降低,與既往研究結論一致。

丁酸梭菌以及Streptococcusdentisani的變化同樣值得關注。本研究發(fā)現(xiàn),這兩種細菌在結直腸癌早期病變患者體內顯著下降,且隨著病情發(fā)展細菌豐富度降低。丁酸梭菌是一種常見于人體腸道的嚴格厭氧菌細菌。有研究報道,小鼠口服丁酸梭菌能夠調節(jié)消化道菌群,提升益生菌豐富度,并能通過引導F4/80+CD11b+腸道巨噬細胞產(chǎn)生IL-10從而抑制小鼠急性結腸炎[18-19]。實驗研究顯示,丁酸梭菌能起到減少腸道腫瘤發(fā)生的作用[20]。Strepto-coccusdentisani是一種存在于健康人牙菌斑內的正常細菌,研究顯示其不產(chǎn)生毒素并且能夠通過產(chǎn)生細菌素抑制主要口腔致病菌的生成以及緩沖過酸性pH條件,被認為是一種益生菌[21]。除此之外,屬于人體腸道常見共生菌的韋榮球菌屬[22]的菌種(如Veillonelladispar)也被發(fā)現(xiàn)在進展期腺瘤患者糞便中減少。

本研究觀察到進展期腺瘤和良性病變患者的α多樣性與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義,且加權Unifrac距離并未顯示菌群存在結構變化。造成該結果的原因可能是,糞便菌群與病變黏膜細菌相比,受到更多因素的影響[10]。

本研究結果顯示,大部分在患者體內有顯著差異的細菌并非隨疾病惡性程度豐富度增加或減少。在良性病變患者體內發(fā)現(xiàn)克雷伯氏菌屬、乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬、Akkermansia等細菌顯著升高的現(xiàn)象,猜測可能是由于良性病變導致了某些益生菌代償性地增加。由于目前對良性病變患者腸道細菌變化規(guī)律和特定細菌生理特性的研究較少,尚無法判斷出現(xiàn)此情況的具體原因。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)進展期腺瘤、良性病變(單純性腺瘤與增生性息肉)患者體內腸道菌群與對照組相比在整體結構和多種細菌上有顯著的變化,進展期腺瘤患者體內牙周病致病菌豐富度上升、益生菌豐富度下降,良性病變患者體內多種益生菌豐富度發(fā)生變化。上述變化可能與結直腸癌早期病變的發(fā)生發(fā)展有關。本研究對結直腸癌早期病變的腸道菌群變化規(guī)律做了初步探索,為結直腸癌病變的早期階段與腸道菌群變化的關系提供了線索。