朱紅梅， 王 姚， 曾奇璐， 楊 慧， 曹 鑫

(成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都 610106)

0 引 言

中藥類風(fēng)濕復(fù)方由青風(fēng)藤、延胡索、海桐皮、片姜黃4味藥材組成.青風(fēng)藤性平，味辛苦，入脾、肝，祛風(fēng)濕，通經(jīng)絡(luò)，常用于風(fēng)濕痹痛，關(guān)節(jié)腫脹，麻痹瘙癢，為君藥；延胡索性溫，味辛苦，具活血行氣，止痛之功，為臣藥；片姜黃性溫味辛，具破血行氣、通經(jīng)止痛之力，為佐藥；海桐皮性平，味辛苦，能祛風(fēng)除濕，常用于風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛，腰腿酸痛，引藥入經(jīng)，為使藥.四藥合用，互相協(xié)同，具有祛風(fēng)除濕，消炎止痛之效，可治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕痛等癥[1].中藥復(fù)方的提取工藝對復(fù)方藥效有著重要的影響，目前的研究多以指標(biāo)成分來確定復(fù)方提取工藝路線.星點設(shè)計是在二水平析因設(shè)計的基礎(chǔ)上加上星點及中心點而成的實驗次數(shù)較少、適宜進(jìn)行非線性擬合的實驗設(shè)計方法，已廣泛應(yīng)用于制劑工藝優(yōu)化的各個環(huán)節(jié)[2-4].

1 材料與儀器

1.1 材 料

實驗所用材料包括：青風(fēng)藤(批號，54191101)、片姜黃(批號，20170226)，購自北京同仁堂北京三和藥業(yè)有限公司；延胡索(批號，20170220)，購自成都市荷花池中藥材市場；海桐皮(批號，501002448)，購自北京同仁堂亳州飲片有限公司；青藤堿(批號，wkp16031603，HPLC>98%)、延胡索乙素(批號，141021，HPLC>98%)、吉馬酮對照品(批號，150810，HPLC>98%)，購自四川省維克奇生物科技有限公司；95%乙醇、氨水、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三乙胺、無水乙醇、氨水、甲醇、磷酸，購自成都科龍化工試劑廠.HPLC用甲醇、乙腈為色譜純，水為怡寶純凈水，其余試劑均為分析純.

1.2 儀 器

實驗所用儀器包括：BS-6KH電子天平(上海友聲衡器有限公司)；BJ-150型高速多功能粉碎機(拜杰公司)；FA-2004型分析電子天平(上海良平儀器儀表有限公司生產(chǎn))；P-230 II型高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司)；KQ-100E型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；101-1-S型電熱鼓風(fēng)干燥箱(成都雅源科技有限公司)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)；DZTW型電子調(diào)溫電熱套(天津靜?？h工興電器廠)；酒精計(武強同輝儀表廠).

2 方法與結(jié)果

2.1 指標(biāo)成分的測定

2.1.1 青藤堿.

1)色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗.以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇—磷酸鹽緩沖液(0.005 mol/L磷酸氫二鈉溶液，以0.005 mol/L磷酸二氫鈉調(diào)節(jié)pH值至8.0，再以1%三乙胺調(diào)節(jié)pH值至9.0)(55∶45)為流動相，檢測波長為262 nm，流速為1 mL/min[1].

2)對照品溶液的制備.取青藤堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.7184 mg的對照品溶液.精密量取上述對照品溶液，配制成濃度分別為0.3592 mg/mL、143.68 μg/mL、57.472 μg/mL、28.736 μg/mL的對照品溶液.

3)線性關(guān)系考察.分別吸取上述5種對照品溶液，按照“2.1.1"項下色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積.以峰面積為縱坐標(biāo)，青藤堿進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為，Y=1008.9X+2.6597(R2=0.9998).結(jié)果表明，青藤堿在0.2873～7.184 μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好線性關(guān)系.

4)供試品溶液的制備.取提取液適量經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得.

2.1.2 延胡索乙素.

1)色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗.以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-0.1%磷酸溶液(三乙胺調(diào)節(jié)pH值至6.0)(65∶35)為流動相，檢測波長為280 nm，流速為1 mL/min[1].

2)對照品溶液的制備.取延胡素乙素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.5328 mg的對照品溶液.精密量取上述對照品溶液，配制成濃度分別為0.2664 mg/mL、106.56 μg/mL、42.624 μg/mL、21.312 μg/mL的對照品溶液.

3)線性關(guān)系考察.分別吸取上述5種對照品溶液，按照“2.1.2"項下色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積.以峰面積為縱坐標(biāo)，延胡索乙素進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為，Y=725.65X+15.741(R2=0.9999).結(jié)果表明，延胡索乙素在0.213～5.328 μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好線性關(guān)系.

4)供試品溶液的制備.取提取液適量經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得.

2.1.3 吉馬酮.

1)色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗.以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈—水(60∶40)為流動相，檢測波長為215 nm，流速為1 mL/min[1].

2)對照品溶液制備.取吉馬酮對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含367.2 μg的對照品溶液.精密量取上述對照品溶液，配制成濃度分別為73.44 μg/mL、29.376 μg/mL、14.688 μg/mL、5.8275 μg/mL的對照品溶液.

3)線性關(guān)系考察.分別吸取上述5種對照品溶液，按照“2.1.3"項下色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積.以峰面積為縱坐標(biāo)，吉馬酮進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為，Y=2881.9X+11.709(R2=1).結(jié)果表明，吉馬酮在0.058～3.672 μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好線性關(guān)系.

4)供試品溶液的制備.取提取液適量經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得.

2.1.4 固含物量測定.

精密量取4味藥材的提取液50 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴鍋上蒸干后，于干燥箱中105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量.

2.2 星點設(shè)計——效應(yīng)面法

2.2.1 單因素實驗.

1)乙醇濃度考察.研究表明，青風(fēng)藤、延胡索、海桐皮主要成分均為生物堿[5-9]，且多采用乙醇為溶媒提取，故本研究同樣選擇乙醇溶液為溶媒.稱取青風(fēng)藤45 g、延胡索30 g(浸泡12 h以上)、海桐皮45 g，分別用8倍50%、60%、70%、80%、90%的乙醇加熱回流提取3次，每次1.5 h，濾過，合并提取液.按照“2.1"項下的方法測定青藤堿、延胡索乙素的含量和固含物量.結(jié)果按青藤堿量—延胡索乙素量—固含物量=35∶35∶30進(jìn)行綜合評分計算，結(jié)果見圖1.結(jié)果表明，綜合評分分?jǐn)?shù)先是隨乙醇濃度增大而增加，后隨之下降，當(dāng)乙醇濃度為70%時，綜合評分最高，故將70%乙醇定為提取溶媒.

2)乙醇用量考察.稱取青風(fēng)藤45 g、延胡索30 g(浸泡12 h以上)、海桐皮45 g，分別用4、6、8、10、12倍70%的乙醇加熱回流提取3次，每次1.5 h，濾過，合并提取液.按照“2.1"項下的方法測定，結(jié)果見圖1.結(jié)果表明，綜合評分分?jǐn)?shù)先是隨乙醇用量增大而增加，后隨之下降，當(dāng)溶媒倍數(shù)為8倍時，提取液綜合評分最高，故將提取的溶媒倍數(shù)定為8倍.

3)提取時間考察.稱取青風(fēng)藤45 g、延胡索30 g(浸泡12 h以上)、海桐皮45 g，分別用8倍50%的乙醇加熱回流提取3次，每次分別0.5、1、1.5、2、2.5 h，濾過，合并提取液.按照“2.1"項下的方法測定，結(jié)果見圖1.結(jié)果表明，當(dāng)提取時間為1 h時，提取液綜合評分最高，故選擇提取時間為1 h.

4)提取次數(shù)考察.稱取青風(fēng)藤45 g、延胡索30 g(浸泡12 h以上)、海桐皮45 g，分別用8倍50%的乙醇加熱回流提取1、2、3、4次，每次1 h，濾過，合并提取液.按照“2.1"項下的方法測定，結(jié)果見圖1.結(jié)果表明，當(dāng)提取次數(shù)為3時綜合評分最高，故將提取次數(shù)定為3次.

圖1乙醇濃度(A)、溶劑用量(B)、提取時間(C)和提取次數(shù)(D)對綜合評分的影響

2.2.2 星點設(shè)計——效應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝.

以乙醇濃度(A)(50%～90%)，溶媒倍數(shù)(B)(8～12倍)，提取時間(C)(30～90 min)為考察因素，以指標(biāo)成分青藤堿、延胡索乙素的含量和固含物量的綜合評分為評價指標(biāo).稱取青風(fēng)藤45 g、延胡索30 g(浸泡12 h以上)、海桐皮45 g，按照星點設(shè)計——效應(yīng)面法安排實驗.實驗因素水平表見表1，實驗分組與結(jié)果見表2.

表1 實驗因素水平表

1)模型擬合與預(yù)測評價.采用Design-Expert V8.0.6軟件，以各綜合評分值對自變量進(jìn)行多元線性回歸和二項式擬合[10]，線性方程為，

Y=96.09635-0.5033X1+0.91854X2+

10.0096X3

(R2=0.5319，P=0.0059)

二項次方程為：

Y=211.79685+0.4989X1-15.6395X2-

122.33112X3+(5.48008E-0.03)X1X2+

0.71771X1X3+11.00258X2X3-

(R2=0.7336，P=0.0460)

根據(jù)統(tǒng)計軟件對各項系數(shù)進(jìn)行的t檢驗結(jié)果，

表2 實驗分組與結(jié)果

刪除P>0.5的項后，再進(jìn)行二項式方程擬合，達(dá)到簡化模型目的，所得方程為，

Y=206.12217-0.5033X1-10.08404X2-

100.01622X3+11.00258X2X3

(R2=0.6346，P=0.0030)

從擬合方程相關(guān)系數(shù)可見，多元線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)較低，而多元二項式擬合方程相關(guān)系數(shù)較高，擬合效果較好.通過Design-Expert V8.0.6.軟件預(yù)測分析，獲得一組綜合評分響應(yīng)值最大的優(yōu)化條件為：X1為50.00%，X2為8.00倍，X3為0.66 h.

2)驗證實驗.稱取青風(fēng)藤45 g、延胡索30 g、海桐皮45 g，用8倍50%的乙醇加熱回流提取3次，每次40 min，濾過，合并提取液，平行3次.按照“2.1"項下的方法測定青藤堿、延胡索乙素的含量以及固含物量，并將預(yù)測值與實測值進(jìn)行偏差計算，結(jié)果見表3.

表3 驗證實驗結(jié)果

注:偏差=(預(yù)測值-實測值)/預(yù)測值×100%

由表3可知，預(yù)測值與實測值間的偏差的平均值為11.31%，綜合評分RSD為1.92%.結(jié)果表明，采用星點設(shè)計——效應(yīng)面法選擇的中藥類風(fēng)濕復(fù)方提取工藝重復(fù)性好，擬合結(jié)果合理、可靠穩(wěn)定.

2.3 正交設(shè)計

2.3.1 單因素實驗(藥材粒徑考察).

取片姜黃藥材(直徑約為1 cm)、片姜黃粗粉各50 g，以70%的乙醇滲漉，滲漉速度為3 mL/min，收集400 mL滲漉液.按照“2.1"項下的方法測定吉馬酮量和固含物量，結(jié)果見表4.結(jié)果表明，當(dāng)藥材大小為粗粉時，吉馬酮量和固含物量最高，故選擇藥材粗粉進(jìn)行提取研究.

表4 片姜黃滲漉藥材大小考察

2.3.2 正交設(shè)計優(yōu)化提取工藝.

以乙醇濃度(A)，滲漉速度(B)，滲漉液的量(C)為考察因素，以指標(biāo)成分吉馬酮量和固含物量的綜合評分為評價指標(biāo).分別稱取片姜黃藥材粗粉各50 g，按照L9(34)正交表安排實驗.因素水平表見表5，正交試驗設(shè)計與結(jié)果見表6，方差分析見表7.

表5 正交試驗因素水平表

表6 正交試驗設(shè)計與結(jié)果

表7 方差分析

由表6、7結(jié)果可知，各因素對提取的影響程度為C>A>B，且各因素對提取效果的影響均無顯著性影響.因此，根據(jù)K值并結(jié)合工業(yè)大生產(chǎn)實際，確定最佳工藝為A2B3C3，即60%乙醇滲漉提取，滲漉速度3 mL/min，收集8倍量濾液.

2.3.3 驗證實驗.

取片姜黃藥材粗粉50 g，平行3組，按照正交試驗優(yōu)選的最佳提取工藝條件進(jìn)行驗證實驗，結(jié)果見8.

表8 片姜黃提取工藝驗證實驗結(jié)果

由表8可知，吉馬酮含量RSD為2.29%，固含物量RSD為1.88%，表明所選工藝穩(wěn)定可行.

3 討 論

中藥類風(fēng)濕復(fù)方由青風(fēng)藤、延胡索、海桐皮、片姜黃4味藥材組成，臨床上多將該4味藥材用酒浸泡后成藥酒涂抹于病變處.相關(guān)研究表明，青風(fēng)藤、延胡索、海桐皮主要成分均為生物堿，且多采用乙醇為溶媒回流提取.本研究結(jié)合藥材有效成分提取工藝并考慮實際生產(chǎn)成本等因素，將青風(fēng)藤、延胡索和海桐皮一起提取，采用單因素實驗和星點設(shè)計——響應(yīng)面法結(jié)合的方式對藥材的提取工藝進(jìn)行研究，對片姜黃采用乙醇滲漉提取，并采用單因素實驗和正交試驗相結(jié)合的方式對藥材的提取工藝參數(shù)進(jìn)行研究.

星點設(shè)計——效應(yīng)面優(yōu)化青風(fēng)藤、延胡索、海桐皮提取工藝，預(yù)測值與實測值間的偏差平均值為11.31%，略大，可能的原因為驗證實驗與工藝優(yōu)化工藝時間間隔較長.驗證實驗綜合評分RSD為1.92%，較穩(wěn)定，表明采用星點設(shè)計——效應(yīng)面法選擇的中藥類風(fēng)濕復(fù)方提取工藝重復(fù)性好，擬合結(jié)果合理，可靠穩(wěn)定.正交設(shè)計方差分析結(jié)果顯示，因素?zé)o顯著性影響(P>0.05)，本研究則根據(jù)K值并結(jié)合生產(chǎn)需要確定提取工藝，并進(jìn)行驗證實驗，表明正交設(shè)計所選工藝穩(wěn)定可行.本研究所確定的中藥類風(fēng)濕復(fù)方提取工藝穩(wěn)定可行.