王 鵬， 蔣 超，常 強， 崔 磊，閆寅卓， 李 紅， 劉海坡， 韓興林，*

(1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院， 北京 100027； 2.安徽文王釀酒股份有限公司， 安徽 臨泉 236400； 3.中國酒業(yè)協(xié)會， 北京 100833)

中國白酒歷史悠久、種類繁多，至此已經(jīng)形成十二種香型白酒[1]。濃香型白酒作為我國傳統(tǒng)白酒的典型風(fēng)味之一，深受消費者喜愛，是我國白酒中最有影響力的酒種之一[2-3]。文王貢酒是安徽濃香型白酒的代表作之一，因為酒質(zhì)綿軟、醇甜，帶有綿甜風(fēng)格，所以也稱之為綿甜型白酒。

濃香型白酒的生產(chǎn)是以酒醅為原料，以窖池為發(fā)酵容器，采用開放式的固態(tài)發(fā)酵模式進行的多菌種復(fù)合發(fā)酵[4-8]。濃香型白酒的釀造過程與微生物菌群的演化交替密不可分，窖內(nèi)微生物經(jīng)過長期的馴化和發(fā)展，慢慢形成了獨特的微生物群落。酒醅中富含豐富的微生物，這些微生物的代謝產(chǎn)物是形成白酒獨特風(fēng)味與口感的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[9]。因此，研究白酒發(fā)酵過程中酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)可以了解白酒的發(fā)酵機理，解析釀造過程中的功能微生物，同時對白酒生產(chǎn)有著重要的指導(dǎo)意義[10]。

傳統(tǒng)菌群分析采用涂布分離純菌株，然后進行分子鑒定，操作復(fù)雜，同時絕大多數(shù)的微生物是不能夠被培養(yǎng)或者很難被培養(yǎng)，大量菌群的遺漏導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確[11]。高通量測序技術(shù)可以滿足對多個樣品中的微生物進行深入分析，其主要特點是通量高、速度快、準(zhǔn)確度高、實時檢測、數(shù)據(jù)信息量大等，能在很短時間內(nèi)獲取大量的數(shù)據(jù)[12-13]。本文利用高通量測序技術(shù)對綿甜型白酒酒醅中原核微生物的構(gòu)成進行分析，以期為綿甜型白酒功能微生物的篩選應(yīng)用，優(yōu)化發(fā)酵工藝提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

窖池1號、窖池2號：安徽文王釀酒股份有限公司中試車間濃香型窖池；Fast DNA Spin Kit for Soil試劑盒，美國MP公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Miseq型高通量測序儀，美國Illumina公司；BioSpec-nano型核酸蛋白檢測儀，德國Eppendorf公司；2-16N型高速微量離心機，湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司；Voetex-genie 2型多功能渦旋振蕩器，北京開源國創(chuàng)科技有限公司；Mini Beadbeater型研磨珠均質(zhì)器，北京優(yōu)尼康生物科技有限公司；ES500型電子天平，上海仁沃實業(yè)發(fā)展有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1取樣方法

選取文王貢酒的2個窖池，跟蹤采集窖內(nèi)不同空間位置及不同發(fā)酵階段的酒醅。取樣位置分為上中下3層，其中窖深1.6 m，表層面糟0.2 m，上層取樣點(距窖頂0.6 m處)、中層取樣點(距窖頂1 m處)、下層取樣點(距窖頂1.4 m處)。

文王貢酒發(fā)酵車間窖池發(fā)酵周期為46 d，取樣時間設(shè)為發(fā)酵1、7、13、21、31、46 d。發(fā)酵期間窖池密封，取樣時使用取樣器通過取樣口直接插入酒醅進行取樣，不破壞窖池整體的密封環(huán)境。每層取3點酒醅樣品均勻混合，混勻后，分裝于無菌真空塑料袋，置于冰盒運回實驗室，-20 ℃保藏，盡快進行DNA提取實驗。

本實驗樣本DXLY和DXHY(X表示天數(shù)，Y表示窖池取樣點的空間位置)分別表示1號窖池酒醅樣品和2號窖池酒醅樣品。

1.3.2酒醅中DNA的提取

1)加入300 mg研磨好的酒醅粉末到Lysing Matrix E管中。加入978 μL磷酸鈉緩沖液和122 μL MT緩沖液。

2)在多功能渦旋振蕩器中處理1)中離心管30 s。

3)將Lysing Matrix E管以14 000 r/min離心10 min。

4)將上清液轉(zhuǎn)移到一個新的2 mL離心管中，加入250 μL PPS，并用手搖10次進行混合。

5)以14 000 r/min離心5 min，至形成球狀沉淀物，將上清液轉(zhuǎn)移到一個新的5 mL離心管，并加入1 mL Binding Matrix Suspension。

6)放到旋轉(zhuǎn)體或用手顛倒2 min，使DNA附著到基質(zhì)上，把離心管放到架子上靜置3 min。

7)小心去除500 μL上清液，避免擾動沉淀的Binding Matrix，重懸剩余的上清液；轉(zhuǎn)移大約600 μL的混合液到一個SPINTMFilter中，以14 000 r·min-1離心1 min；將SPINTMFilter下面收集管中的液體倒掉；重復(fù)轉(zhuǎn)移混合液過程直到剩余混合液全部轉(zhuǎn)移離心完(1.5 mL酒醅樣品一般要轉(zhuǎn)移3次)。

8)加入500 μL SEWS-M到SPINTMFilter中，以14 000 r/min離心1 min；將SPINTMFilter下面收集管中的液體輕輕倒掉，再以14 000 r/min離心2 min，去除基質(zhì)中的SEWS-M。

9)將SPINTMFilter放到一個新的收集管中，在室溫下風(fēng)干SPINTMFilter 5 min。

10)加入50 μL DES，用移液槍槍頭在濾膜上輕輕攪動，使濾膜上的沉淀物重懸，從而使DNA有效洗提；以14 000 r/min離心1 min，使DNA轉(zhuǎn)移到收集管中。

11)處理好的樣品置于-20 ℃保藏、備用。

1.3.3酒醅DNA濃度及純度檢驗

采用核酸蛋白檢測儀檢測酒醅樣品DNA濃度及純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅DNA濃度及純度檢測結(jié)果

通過對酒醅樣品進行核酸蛋白檢測，得到酒醅樣品的DNA濃度和純度，結(jié)果見表1。由表1可以看出，從酒醅中提取的DNA質(zhì)量濃度均在13 μg/mL以上，其OD260/280值在1.5～2.1。檢測所得曲線線性較好，適宜于PCR擴增及后期的高通量測序。

表1 酒醅樣品濃度及純度

2.2 酒醅中原核微生物群落多樣性指數(shù)分析

用Alpha Diversity分析酒醅樣品內(nèi)的群落多樣性。對不同樣品在不同一致性閾值水平(默認提供97%、95%兩個閾值)下的Alpha Diversity分析的指數(shù)進行統(tǒng)計[14]。其中，97%水平下聚類成為一個OTU的序列被認為可能是源自于同一個種的序列；95%水平下聚類成為一個OTU的序列被認為可能是源自于同一個屬的序列[15]。Shannon、Simpson、Chao1和ACE是反應(yīng)樣品豐富度和多樣性的重要指標(biāo)，微生物群落多樣性與Shannon成正比，Shannon越大，微生物群落多樣越豐富，結(jié)果見表2。由表2可以看出，細菌群落檢測覆蓋率均在99.4%以上，基本可以反映出酒醅樣品中全部的原核微生物多樣性及結(jié)構(gòu)。從樣品種類來看，1號窖池酒醅中的原核微生物多樣性要高于2號窖池酒醅中的原核微生物。

表2 酒醅樣品中原核微生物群落多樣性指數(shù)

圖1 細菌的操作分類單元維恩圖Fig.1 Venn diagram of operational taxonomic units of bacteria

2.3 OTU分析

為了研究酒醅中物種的組成多樣性信息，用Uparse軟件對所有酒醅樣品的全部Effective Tags 序列聚類，提供以97%的一致性將序列聚類成為OTUs結(jié)果[16]。按所有酒醅樣品間序列最小值對OTUs聚類結(jié)果進行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，根據(jù)OTUs聚類分析結(jié)果和研究需求，分析不同酒醅樣品之間的OTUs的共有、特有信息，并繪制韋恩圖，展示結(jié)果見圖1。

由圖1(a)可以看出，1號、2號窖池酒醅中分別含有細菌種類1 304、1 036個。1號和2號窖池酒醅中含有相同種類細菌914個，可以看出，1號窖池和2號窖池酒醅中的原核微生物種類相似度較高。

由圖1(b)可以看出，1號窖池第1天上、中、下層酒醅中分別含有細菌種類827、816、790個，上、中、下三層酒醅中含有相同種類的細菌489個。由圖1(c)可以看出，2號窖池第1天上、中、下層酒醅中分別含有細菌種類585、572、663個，上、中、下三層酒醅中含有相同種類的細菌363個。由圖1(d)可以看出，1號窖池第46天上、中、下層酒醅中分別含有細菌種類160、212、269個，上、中、下三層酒醅中含有相同種類的細菌110個。由圖1(e)可以看出，2號窖池第46天上、中、下層酒醅中分別含有細菌種類129、117、107個，含有相同種類的細菌59個。由此可以看出，同一個窖池中原核微生物種類相似度很高，1號窖池中原核微生物的種類要高于2號窖池；同時，隨著發(fā)酵的進行，窖內(nèi)各種營養(yǎng)物質(zhì)被逐漸消耗，酒醅酸度增大，酒精含量升高，窖內(nèi)環(huán)境變得更加惡劣，不適于微生物的生長，致使2個窖池酒醅中的細菌種類不斷減少。

2.4 在門水平上酒醅中原核微生物群落結(jié)構(gòu)分析

酒醅中不同微生物群落分布和種類差異對產(chǎn)酒品質(zhì)具有重要的影響。Uparse構(gòu)建OTUs時會選取代表性序列，將這些代表性序列集合用RDP Classifier與GreenGene數(shù)據(jù)庫進行物種注釋分析(設(shè)定閾值為0.8～1)[17-18]。根據(jù)物種注釋，統(tǒng)計每個樣品在各分類水平上的序列數(shù)目，根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取在門分類水平上最大相對豐度排名前十的門，生成的物種相對豐度分布柱形圖見圖2。

由圖2可以看出，1號窖池和2號窖池酒醅中的原核微生物菌群種類相似，同時菌群種類變化趨勢相同。1號窖池和2號窖池酒醅中的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門(Firmicutes)、藍細菌門(Cyanobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)。優(yōu)勢菌門的數(shù)量由多到少排列順序為：Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Cyanobacteria、Gemmatimonadetes。發(fā)酵前期菌群種類較多，這是由于窖內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)豐富，同時氧氣含量較高，酒醅酸度較低，所以一些好氧細菌，例如Actinobacteria豐度較大。但是隨著發(fā)酵的進行和窖內(nèi)微環(huán)境的改變，優(yōu)勢菌種越來越占有優(yōu)勢，致使其他菌群的數(shù)量逐漸減少。隨著發(fā)酵的進行，F(xiàn)irmicutes的豐度越來越大，分析原因主要是由于窖內(nèi)各種營養(yǎng)物質(zhì)的逐漸消耗，且酒醅酸度和酒精含量逐漸加大，窖內(nèi)微生態(tài)環(huán)境變得更加惡劣，從而不適于大量微生物的生長，造成窖內(nèi)微生物死亡，僅有少量適應(yīng)酸性厭氧環(huán)境的微生物生長。很多厚壁菌可以產(chǎn)生內(nèi)生孢子，它可以抵抗極端環(huán)境，所以在發(fā)酵中后期厚壁菌門的豐度最大。

圖2 在門分類水平上酒醅樣品細菌菌群所占比例Fig.2 Relative proportions of bacterial flora of fermented grains samples at phylum level

2.5 在屬水平上酒醅中原核微生物群落結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)所有酒醅樣品在屬水平的物種注釋及豐度信息，選取豐度排名前35的屬及其在每個酒醅樣品中的豐度信息繪制熱圖，并從分類信息和樣品間差異兩個層面進行聚類，便于結(jié)果展示和信息發(fā)現(xiàn)，從而找出酒醅樣品中聚集較多的物種，結(jié)果展示見圖3。

圖中的每一個小方格代表所對應(yīng)酒醅樣品中(橫坐標(biāo))菌(縱坐標(biāo))的相對豐度，方格紅色越紅說明該菌的相對豐度越高。圖3 在屬分類水平上酒醅樣品細菌菌群構(gòu)成的熱圖Fig.3 Heatmap of bacterial flora of fermented grains samples at genus level

由圖3可以看出，酒醅樣品中原核微生物可分為Actinobacteria、Bacteroidetes、Cyanobacteria、Deinococcus-Thermus、Euryarchaeota、Firmicutes、Proteobacteria，共7個門。1號窖池上層細菌中，大腸桿菌志賀菌屬(Escherichia-shigella)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、芽孢八疊球菌屬(Sporosarcina)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、谷氨酸桿菌屬(Glutamicibacter)、甲烷細菌屬(Methanobacterium)相對豐度較高。1號窖池中層細菌中，谷氨酸桿菌屬(Glutamicibacter)相對豐度較高。2號窖池中層細菌中，Malikia、脫氯單胞菌屬(Dechloromonas)、棲熱菌屬(Thermus)、硫化細菌屬(Vulcaniibacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus)相對豐度較高。2號窖池下層細菌中，擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)、雷氏菌屬(Ralstonia)相對豐度較高。1號窖池第7天的酒醅樣品中，類芽孢桿菌屬(Macellibacteroides)、擬桿菌屬(Bacteroides)、森氏梭狀芽孢桿菌屬1(Clostridiumsensustricto1)相對豐度較高。1號窖池第13天的酒醅樣品中，瘤胃桿菌屬(Rummeliibacillus)和醋酸桿菌屬(Acetobacter)相對豐度較高。1號窖池第46天下層酒醅樣品中，普雷沃氏菌屬9(Prevotella9)相對豐度較高。在發(fā)酵前期，相對豐度較高的菌屬較多，隨著發(fā)酵的進行，相對豐度較高的菌屬數(shù)量越來越少。

3 結(jié) 論

本實驗通過對酒醅樣品進行高通量測序，得到結(jié)果：

1)通過對酒醅中原核微生物群落多樣性指數(shù)分析可以得到，1號窖池酒醅中的原核微生物多樣性要高于2號窖池酒醅中的原核微生物。

2)為了研究酒醅中物種的組成多樣性信息，對酒醅樣品進行OTU分析，可以得出隨著發(fā)酵的進行2個窖池酒醅中的細菌種類在不斷減少。1號窖池酒醅和2號窖池酒醅的原核微生物種類相似度較高。在同一窖池中，不同的空間位置，原核微生物種類相似度很高。

3)在門水平上酒醅中原核微生物群落結(jié)構(gòu)分析，可以得到1號窖池和2號窖池酒醅中的原核微生物菌群種類相似，同時菌群種類變化趨勢相同。優(yōu)勢菌門的數(shù)量由多到少排列順序為：Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Cyanobacteria、Gemmatimonadetes。隨著發(fā)酵的進行和窖內(nèi)微環(huán)境的改變，窖內(nèi)的菌群種類逐漸減少，不適于大量微生物的生長，而厚壁菌產(chǎn)生的內(nèi)生孢子可以抵抗極端環(huán)境，所以在發(fā)酵中后期厚壁菌門的豐度最大。

4)在屬水平上酒醅中原核微生物群落結(jié)構(gòu)分析，可以得到1號窖池酒醅中Escherichia-shigella，Psychrobacter，Sporosarcina，Bacillus，Glutamicibacter，Methanobacterium，Macellibacteroides，Bacteroides，Clostridiumsensustricto1，Rummeliibacillus，Acetobacter，Prevotella9相對豐度較高。2號窖池酒醅中Malikia，Dechloromonas，Thermus，Vulcaniibacterium，Streptococcus，Nocardiopsis，Ralstonia相對豐度較高。隨著發(fā)酵的進行，相對豐度較高的菌屬數(shù)量越來越少。