于 洋 ，梁小軍 ，高蕙蘭

（1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，寧夏 銀川 750002；2.寧夏固原市原州區(qū)動(dòng)物疾控中心，寧夏 固原 750003）

FecB基因是在綿羊中識別出的第一個(gè)高繁殖力主效基因。近年來研究發(fā)現(xiàn)，湖羊存在FecB基因，即BMPR-ⅠB基因突變。灘羊是我國特有的輕裘皮用單羔綿羊品種，繁殖力低下是限制灘羊生產(chǎn)性能發(fā)揮的主要因素之一。為了合理利用灘羊的種質(zhì)特性，同時(shí)發(fā)揮湖羊多胎高產(chǎn)的優(yōu)勢，以灘羊?yàn)楦副?、湖羊?yàn)槟副?，再以灘湖F2代為母本、灘羊?yàn)楦副具M(jìn)行雜交，得到灘湖雜交羊F2代。該研究借鑒已報(bào)道的綿羊多胎主效基因FecBPCRSSCP檢測方法［1］，對灘湖雜交羊 F2代血液樣本中的FecB基因進(jìn)行分析，以期為生產(chǎn)實(shí)踐中采用常規(guī)表型選擇育種方法與FecB基因分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)相結(jié)合的方式開展灘羊多胎品種（系）的培育工作提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取灘湖雜交羊F2代549只，其中，282只來自平羅寧羊發(fā)展集團(tuán)，267只來自寧夏朔牧鹽池灘羊繁育有限公司。每只羊頸靜脈采血3～5 mL，用1%肝素鈉抗凝，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 綿羊全血DNA提取及檢測：使用天根全血基因組DNA提取試劑盒提取綿羊全血DNA，通過分光光度計(jì)與0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取效果。

1.2.2 引物序列：預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小為187 bp。上游引物序列為：AGATTGGAAAAGGTCGCTATG，下游引物序列為：ACCCTGAACATCGCTAATACA。

1.2.3 FecB基因PCR擴(kuò)增體系及條件：PCR擴(kuò)增體系為 20 μL， 其中，PCR Master Mix 10 μL，DNA模板（100 ng/μL）1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 0.2 μL，使用 ddH2O 補(bǔ)至 20 μL。PCR 擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性 5 min；95℃變性 40 s，65℃退火45 s，72℃延伸 45 s，33個(gè)循環(huán)；72℃最后延伸5 min；4℃保存。

1.2.4 PCR產(chǎn)物檢測：使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測。

1.2.5 PCR-SSCP分析：聚丙烯酰胺凝膠的制備采用常規(guī)方法。聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟如下：吸取 2 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與7 μL變性緩沖液混合；98℃變性10 min，取出后冰浴7 min完成變性；切斷電泳槽電源，將已變性的混合液用10 μL移液器準(zhǔn)確點(diǎn)入每個(gè)膠孔中，靜置約10 min，使樣品全部下沉；然后接通電源，在15 V/cm恒定電壓下電泳 5～10 min，觀察到溴芬蘭（深藍(lán)色）和二甲苯氰（藍(lán)綠色）兩條帶分開后，在5～7 V/cm恒定電壓下電泳 16 h。

聚丙烯酰胺凝膠銀染染色液配制采用常規(guī)方法。聚丙烯酰胺凝膠染色過程如下：①洗膠：電泳40 min結(jié)束后，將凝膠小心取下放入超純水中60 r/min漂洗2 min；②染色：將漂洗后的凝膠放入500 mL染色液中，60 r/min漂洗30 min，然后用水漂洗30 s；③顯色：將染色后的凝膠放入500 mL顯色液中，60 r/min漂洗約20 min后出現(xiàn)棕色條帶，然后用水漂洗30 s；④固定：將顯色后的凝膠放入500 mL固定液中，60 r/min漂洗 2 min，保留條帶，將保留條帶的膠置于白板上，用凝膠成像儀拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 全血DNA提取檢測結(jié)果

提取的綿羊血液基因組DNA的OD值在1.7～1.9。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果表明，提取的基因組DNA質(zhì)量良好、無降解，可直接用于后續(xù) PCR擴(kuò)增（見圖1）。

圖1 綿羊全血DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

圖2 FecB基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

2.2 FecB基因PCR產(chǎn)物檢測

由圖2可知，利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，得到的產(chǎn)物大小約為187 bp，與預(yù)期結(jié)果一致，表明擴(kuò)增得到了目的產(chǎn)物。

2.3 FecB基因的PCR-SSCP分析

對FecB基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SSCP分析，結(jié)果表明，不同綿羊個(gè)體表現(xiàn)出2種基因型，即 B+型和++型（見圖 3）：條帶 1～3表示攜帶 1個(gè)FecB基因拷貝，即B+型；條帶4～6表示不攜帶FecB基因，即++型。

圖3 FecB基因的PCR-SSCP分析結(jié)果

2.4 FecB基因的等位基因頻率和基因型頻率

灘湖F2代綿羊群體中FecB基因的等位基因頻率和基因型頻率見表1。由表1可知，檢測的灘湖雜交羊F2代群體中不存在BB基因型；在選自寧夏朔牧鹽池灘羊繁育有限公司的綿羊群體中（n=267），等位基因B的頻率為28%，等位基因B+的頻率為 72%，B+基因型的頻率為 55%，++基因型的頻率為45%；在選自平羅寧羊發(fā)展集團(tuán)的綿羊群體中（n=282），等位基因 B的頻率為 24%，等位基因 B+的頻率為 76%，B+基因型的頻率為48%，++基因型的頻率為52%。2個(gè)群體綜合來看（n=549），BB基因型不存在，等位基因B的頻率為26%，等位基因B+的頻率為74%，B+基因型的頻率為52%，++基因型的頻率為48%。

3 討論

Southey 等［2］研究表明，1 個(gè) FecB基因拷貝能夠增加母羊排卵數(shù)1.6枚，攜帶1個(gè)FecB基因拷貝的母羊產(chǎn)羔數(shù)增加0.65只。馬麗娜等［3］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ecB基因能有效提高灘羊個(gè)體的平均產(chǎn)羔數(shù)，且產(chǎn)羔數(shù)隨Y等位基因的增加而增加。李國忠［4］建立了低豐度FecB基因COLD-PCR HRM檢測方法，適用于綿羊FecB基因的大規(guī)?？焖俸Y查工作。李東紅等［5］研究表明，小尾寒羊、湖羊、湖寒雜交羊FecB基因均有 BB、B+、++3個(gè)基因型，在 746 bp處發(fā)生 A→G的突變。羅生金［6］研究表明，含F(xiàn)ecB基因的羊與哈薩克母羊雜交后，F(xiàn)ecB基因顯性效果好，遺傳性能較為穩(wěn)定，進(jìn)一步說明FecB基因是高繁殖率主效基因，可有效提高F1代羊的產(chǎn)羔數(shù)。馬吉鋒等［7］研究發(fā)現(xiàn)，灘湖 F1代BB基因型個(gè)體占6.67%，但該基因型在F2代中未檢測到。額爾和花等［8］對 80只灘湖雜一代綿羊進(jìn)行了FecB基因檢測，發(fā)現(xiàn)該群體中BB基因型個(gè)體占66.7%。

表1 灘湖F2代綿羊群體中FecB基因的等位基因頻率和基因型頻率計(jì)算結(jié)果%

該試驗(yàn)應(yīng)用PCR-SSCP方法對549份灘湖雜交羊F2代血液樣品中的FecB基因進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)BB基因型在灘湖F2代群體中不存在。如果采用基因檢測技術(shù)能夠?qū)⒑蠦基因的個(gè)體選留下來，將有利于提高群體的B基因頻率。下一步可以通過利用基因型選育技術(shù)，結(jié)合傳統(tǒng)選種方法，選留B+基因型的公母羊交配，可顯著改善灘羊FecB基因的基因型結(jié)構(gòu)和基因頻率，提高群體的產(chǎn)羔數(shù)，加快灘羊高繁品種（系）的建立。