徐明舉，李珮瑤，徐 彤，利 凱，田 勇，張瑞華

（河北北方學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室，河北 張家口 075000）

心包積液—肝炎綜合征（hydropericardium hepatitis syndrome，HHS）又稱安卡拉病毒?。?］，該病于1987年最早發(fā)現(xiàn)于巴基斯坦安卡拉地區(qū)［2］，主要表現(xiàn)為心包積液、肝炎等病理特征。1989年在墨西哥、印度、伊拉克、智利、秘魯、俄羅斯和孟加拉國等國家都相繼發(fā)現(xiàn)該?。?-3］。HHS主要是引起 20～30日齡肉雞發(fā)病，發(fā)病后 4～8 d為死亡高峰，病程 8～15 d，死亡率達 20%～80%，一般在30%左右。任傳德等報道我國吉林省于2010年11月某肉雞群發(fā)生HHS［4］。近年來，該病在我國發(fā)病的區(qū)域不斷擴大。除了肉雞感染外，不斷發(fā)現(xiàn)蛋用雛雞和產(chǎn)蛋雞群的發(fā)病報告，因此給我國養(yǎng)雞業(yè)造成了較大的危害和經(jīng)濟損失［5-6］。以上表明我國的雞HHS亦需要引起足夠的重視，這對保護雞群健康和避免養(yǎng)禽業(yè)遭受經(jīng)濟損失有重大研究意義。

2017年，河北省涿鹿縣某個山間林下飼養(yǎng)的60～80日齡綠殼蛋雞青年雞發(fā)生以突然死亡和剖檢表現(xiàn)為心包腔有大量黃色清亮液體、肝臟明顯腫大為特點的急性傳染性疾病，死亡率為36%。經(jīng)臨床癥狀以及剖檢變化初步懷疑為HHS。鑒于HHS在我國部分省區(qū)呈現(xiàn)發(fā)病趨勢不斷擴大的實際，以及目前國內(nèi)有關(guān)HHS的防治缺乏有效的疫苗及相關(guān)藥物的現(xiàn)實，開展HHS相關(guān)的研究迫在眉睫。鑒于以上原因，開展對疑似HHS病例詳細的實驗室診斷，以分離、證實該病病原，為進一步開展疫苗以及相關(guān)防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

實驗用 11日齡 SPF雞胚、10周齡雛雞購于北京實驗動物中心。營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂均為上海博微生物科技有限公司產(chǎn)品，生產(chǎn)批號分別為160419和160528。雞Ⅰ群腺病毒血清4型標(biāo)準(zhǔn)抗原和標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清均為廣州測迪生物科技有限公司產(chǎn)品，生產(chǎn)批號分別為20160428和201602。其他常規(guī)試劑等由預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室提供。

1.2 細菌分離

在無菌條件下取病雞的肝臟組織及心包積液，在麥康凱瓊脂和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上劃線進行細菌分離。經(jīng)37℃培養(yǎng)24 h后，觀察是否有細菌生長。

1.3 病毒分離

無菌條件下剖檢具有典型HHS特征發(fā)病死亡的雞，采集心包積液、肝臟、脾臟、肺、腎臟等樣品裝入1.5 mL試管中，保存于－80℃低溫冰箱、待用。將上述組織取出、按常規(guī)方法處理后，加入青霉素、鏈霉素抑菌處理，10 000 r/min離心10 min取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，將上述濾液經(jīng)尿囊腔途徑接種10只11日齡的雞胚，每胚0.2 mL。接種后每天照胚2次，檢出死亡雞胚，一直孵化至144 h，棄掉24 h內(nèi)死亡雞胚。收獲上述雞胚尿囊液傳代培養(yǎng)，并觀察雞胚病變。

1.4 病毒鑒定

1.4.1 待檢病毒電鏡形態(tài)觀察：收集心包積液、肝臟等樣品接種的11日齡SPF雞胚48 h尿囊液，經(jīng)傳代3次后，取1 mL尿囊液10 000 r/min離心10 min取上清液；13 000 r/min離心1 h，棄去上清液；剩余100 μL混懸液，吹打均勻后滴上2%磷鎢酸染液，片刻后將多余的染液吸干，透射電子顯微鏡下觀察病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.4.2 待檢病毒紅細胞凝集試驗：腺病毒具有凝集不同動物紅細胞的特性，為此制備0.5%的雞、鴨及大鼠紅細胞懸液，按常規(guī)方法進行微量紅細胞凝集試驗。

1.4.3 病毒血清型鑒定：取新鮮病死雞的肝臟，剪碎、研磨，按1∶3比例加入生理鹽水做成混懸液，凍融3次后離心取上清液（為待檢抗原），應(yīng)用陽性血清進行瓊脂擴散沉淀實驗測定待檢抗原。

1.5 感染試驗

收集第5代尿囊液，采用腹腔注射方式接種10只10周齡SPF雞，每只0.2 mL，并設(shè)定對照組，隔離飼養(yǎng)，逐日觀察至第14天。記錄攻毒后雞的臨床表現(xiàn)以及統(tǒng)計死亡率。收集感染雛雞組織，分離病毒。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌分離

在無菌條件下取病雞的肝臟組織以及心包積液，在營養(yǎng)瓊脂和麥康凱瓊脂平板上進行細菌分離。培養(yǎng)24 h后分離到3株大腸桿菌。但利用該3株分離菌接種SPF雞未出現(xiàn)典型臨床癥狀及發(fā)病死亡。

2.2 病毒分離

待檢病毒通過尿囊腔接種于11日齡的SPF雞胚，在6 h的培養(yǎng)觀察中，3枚雞胚于96 h死亡，另有2枚于120 h死亡，至144 h將未死雞胚取出置4℃冰箱過夜。收集雞胚尿囊液，-80℃低溫冰箱保存、待用。觀察發(fā)現(xiàn)其感染的雞胚胚體呈現(xiàn)蜷曲、出血，并且肝臟腫大。

2.3 病毒鑒定

2.3.1 電鏡觀察：在電子顯微鏡下觀察到病毒尿囊液中的大量病毒粒子，其直徑為60～80 nm，呈圓形（見圖1）。

圖1 病毒形態(tài)

2.3.2 紅細胞凝集試驗：血凝試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)該病毒對雞和鴨紅細胞不具備血凝能力，但可以凝集大鼠紅細胞，這與Ⅰ群腺病毒的紅細胞凝集特性相一致。

2.3.3 病毒血清型鑒定：標(biāo)準(zhǔn)抗原孔和陽性血清孔之間出現(xiàn)了1條清晰的乳白色的沉淀線，與陰性血清孔之間沒有沉淀線的出現(xiàn)；待檢孔和陽性血清孔之間出現(xiàn)了1條清晰的沉淀線，并且和標(biāo)準(zhǔn)抗原孔與對照陽性血清孔之間的沉淀線互相吻合，所以證實分離得到的病毒為禽Ⅰ群腺病毒血清4型。

表1 SPF雛雞感染死亡情況只

2.4 感染試驗

接種病毒的雛雞在第4天開始出現(xiàn)死亡，之后陸續(xù)有死亡，一直觀察到攻毒后第8天，死亡總數(shù)達到6只，死亡率已到達60%，從第8天之后沒有再出現(xiàn)死亡情況；而對照組一直到觀察結(jié)束，其臨床表現(xiàn)均正常，并未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象（見表1）。剖檢病死雞可發(fā)現(xiàn)其心肌柔軟，心包有大量淡黃色透明積液；肝臟腫脹、充血，呈土黃色，質(zhì)地脆軟，被膜下有出血點（見圖2）。死亡雞剖檢變化與自然發(fā)病雞一致，均有典型的心包積液—肝炎綜合征的病變特征。

圖2 感染試驗結(jié)果

3 討論

禽腺病毒是引起家禽發(fā)病的常見的病原，禽腺病毒根據(jù)其抗原結(jié)構(gòu)分為3個亞群，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群。Ⅰ群主要是傳統(tǒng)的腺病毒，在雞群中現(xiàn)已分離確定 12 個血清型（FAdv-1～FAdv-12）；Ⅱ群腺病毒主要引起火雞出血性腸炎，Ⅲ群則引起蛋雞的產(chǎn)蛋下降綜合征［7-8］。研究表明，禽腺病毒不同的血清型，甚至是相同血清型的不同毒株，其引起發(fā)病和致死的能力也有所不同，但目前已證實Ⅰ群腺病毒中的血清4型是引起雞心包積液—肝炎綜合征（HHS）的特異性病原［9-10］。

該研究在河北省涿鹿縣某個山間林下飼養(yǎng)的60～80日齡綠殼蛋雞青年雞中采集死亡雞病變組織，通過細菌及病毒的分離、鑒定和動物感染試驗可確定其病原為禽腺病毒血清4型，而心包積液—肝炎綜合征就是由腺病毒屬（Ⅰ亞群禽腺病毒）腺病毒血清4型 （FAdv-4）引起的一種新型家禽疫病。其在各個品種各個年齡的雞都有發(fā)生，而在我國也有 10～20周齡蛋雞感染腺病毒的病例［11-12］。據(jù)任傳德等［4］報道，HHS可導(dǎo)致肉雞的發(fā)病死亡率在20%～80%。梁廣成等［13］報道分離到1株高致病FAdv-4，經(jīng)肌肉接種1 000 EID50病毒量導(dǎo)致3周齡SPF雞的致死率為90%。該試驗物感染試驗結(jié)果與臨床剖檢病變一致，在動物感染試驗中，攻毒雞死亡率為60%。

盡管目前雞心包積液—肝炎綜合征對我國養(yǎng)雞產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，但由于我國目前缺乏有效的商品化疫苗［13-15］，目前尚無有效的防控措施，因此，目前我國防治心包積液—肝炎綜合征多采用綜合性防控措施。建議采取加強飼養(yǎng)管理，預(yù)防接種自家組織滅活苗，緊急注射卵黃抗體，配合使用抗病毒、保肝護腎、利水消腫、增強免疫力、防治繼發(fā)感染的藥物。加強HHS疫苗的研究，采取疫苗免疫成為預(yù)防和控制該病的當(dāng)務(wù)之急。韋悠等以Ⅰ群腺病毒中的FAdv-4和FAdv-8型全毒株制備油乳劑滅活疫苗免疫后攻毒保護率達到100%［16］，提示其疫苗免疫完全可行并具有良好的保護效果。

4 結(jié)論

經(jīng)臨床剖檢和實驗室病毒分離、鑒定，以及SPF雞致病試驗，確定該病為FAdv-4引起的心包積液—肝炎綜合征。