李紅霞，宮海葉，曾 蕭，張素素，劉伯鋒

(1.延安大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，陜西 延安 716000；2.江西省新余市婦幼保健院婦科，江西 新余 338025； 3. 延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖教研室，陜西 延安 716000)

妊娠滋養(yǎng)細胞疾病(gestational trophoblastic disease, GTD)包括葡萄胎(hydatidiform mole, HM)、侵蝕性葡萄胎(invasive mole, IM)、絨毛膜癌(簡稱絨癌,choriocarcinoma, CC)和胎盤部位滋養(yǎng)細胞腫瘤(placental site trophoblastic tumor, PSTT)，其中后三者又統(tǒng)稱為妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤(gestational trophoblastic neoplasia, GTN)，主要是由滋養(yǎng)細胞過度侵襲所致。細胞的過度侵襲涉及多種因子，許多癌基因、原癌基因、細胞因子、生長因子和黏附分子等均在此過程中發(fā)揮作用。妊娠滋養(yǎng)細胞疾病嚴重影響育齡期婦女的健康，甚至威脅生命。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transformation growth factor β1, TGF-β1)和胎盤生長因子(placental growth factor, PLGF)參與妊娠期高血壓疾病、宮頸癌和子宮內(nèi)膜異位癥等多種婦產(chǎn)科疾病的發(fā)生發(fā)展，但關(guān)于上述2種因子在妊娠滋養(yǎng)細胞疾病中的研究報道較少見。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測TGF-β1和PLGF在正常早孕妊娠絨毛組織、葡萄胎組織和妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤組織中的表達情況，研究TGF-β1和PLGF在不同類型妊娠滋養(yǎng)細胞疾病中的意義，為妊娠滋養(yǎng)細胞疾病早期發(fā)現(xiàn)、診斷和預(yù)后判斷提供參考指標。

1 資料與方法

1.1 標本來源 收集2009—2016年延安大學(xué)附屬醫(yī)院收治的妊娠滋養(yǎng)細胞疾病患者共185例。納入標準：①無反饋炎性疾病、異常妊娠史和腫瘤病史等；②組織標本均為手術(shù)病理標本(清宮和子宮切除術(shù))；③術(shù)前均未行免疫治療或放化療；④均經(jīng)臨床和組織病理學(xué)證實；⑤均經(jīng)2位副主任醫(yī)師以上病理科醫(yī)師復(fù)核。妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤26例，設(shè)為GTN組(22例侵蝕性葡萄胎和4例絨癌)，年齡19～50 歲，平均年齡(28.88±6.24)歲；采用單純隨機數(shù)字法選取40例葡萄胎設(shè)為葡萄胎組，年齡20～49 歲，平均年齡(28.23±6.52)歲；所有入選者均有完整的臨床資料及術(shù)后病理石蠟標本。收集同期因計劃外懷孕要求終止妊娠的正常早孕患者的絨毛組織標本40例作為正常對照組。

1.2 主要試劑和儀器 兔抗人TGF-β1多克隆抗體原液(BA0290)、SV0002檢測試劑盒和顯色劑DAB(AR1022)均購于武漢博士德生物技術(shù)有限公司，兔抗人PLGF多克隆抗體原液(bs-0280R)購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。所有實驗儀器及設(shè)備均來自延安大學(xué)附屬醫(yī)院病理科。

1.3 免疫組織化學(xué)染色和結(jié)果判定 將入選的妊娠滋養(yǎng)細胞疾病患者的石蠟標本重新制備5 μm切片，行免疫組織化學(xué)SV0002法染色，嚴格按照試劑盒說明書操作。以PBS替代一抗作為陰性對照，采用已知陽性切片作為陽性對照。采用雙盲法觀測，以細胞膜或細胞漿內(nèi)出現(xiàn)均勻淡黃色、棕黃色或褐色顆粒為陽性染色，根據(jù)細胞膜或細胞漿有無顯色或顯色強弱，結(jié)合半定量分級評分方法判定結(jié)果。按染色強度計分，計分1、2和3分別代表呈淡黃色、棕黃色和黃褐色。鏡下選擇10個高倍視野下100個細胞，計算陽性百分率并取平均值，計分0、1、2、3和4分分別代表陽性細胞數(shù)≤10%、11%～25%、26%～50%、51%～75%和≥76%。2種計分的乘積即為陽性強度， 0～2分為陰性(-)，3～5分為弱陽性(+)，6～8分為中度陽性()，9～12分為強陽性()，乘積>3判定為免疫反應(yīng)陽性。

2 結(jié) 果

2.1 各組研究對象一般資料 各組患者年齡和孕周等一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

2.2 正常絨毛組織、葡萄胎組織和GTN組織中TGF-β1陽性表達率 TGF-β1在正常絨毛組織、葡萄胎和GTN組織中陽性表達于細胞滋養(yǎng)細胞和合體滋養(yǎng)細胞的細胞膜和細胞漿中(圖1，見插頁五)。正常對照組TGF-β1陽性表達率為87.5%，高于葡萄胎組(62.5%)和GTN組(30.8%)， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.667，P=0.01；χ2=22.337，P<0.01)；葡萄胎組TGF-β1陽性表達率高于GTN組(χ2=6.346，P=0.012)。見表2。

表1 正常對照組、葡萄胎組和GTN組研究對象的一般資料

Tab.1 General informations of subjects in normal control group, hydatidiform mole group, and GTN group±s)

2.3 正常絨毛組織、葡萄胎組織和GTN組織中PLGF的陽性表達率 PLGF在正常絨毛組織、葡萄胎和GTN組織中陽性表達于細胞滋養(yǎng)細胞和合體滋養(yǎng)細胞的細胞膜與細胞質(zhì)內(nèi)(圖2，見插頁五)。正常對照組PLGF陽性表達率為22.5%，低于葡萄胎組(50.0%)和GTN組(80.8%)， 組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.545，P=0.011；χ2=21.579，P=0.01)；葡萄胎組PLGF陽性表達率低于GTN組(χ2=6.340，P=0.012)。見表2。

2.4 TGF-β1和PLGF的陽性表達率與葡萄胎惡變高危因素的關(guān)系 并發(fā)高危因素(年齡>40歲、子宮體積>孕周和卵巢黃素化囊腫直徑>6 cm)的葡萄胎患者TGF-β1陽性表達率低于無上述高危因素患者(P<0.05)，而PLGF陽性表達率高于無上述高危因素患者(P<0.05)；人絨毛膜促性腺激素(hCG)>1×105U·L-1和hCG<1×105U·L-1患者TGF-β1和PLGF陽性表達率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。重復(fù)性葡萄胎和無重復(fù)性葡萄胎患者TGF-β1和PLGF陽性表達率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.5 TGF-β1和PLGF陽性表達率與GTN高危因素的關(guān)系 按FIGO 2000滋養(yǎng)細胞腫瘤解剖學(xué)分期及FIGO/WHO預(yù)后評分系統(tǒng)，對妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤進行TGF-β1和PLGF的陽性表達率比較，當GTN患者臨床分期和FIGO預(yù)后評分越高時，TGF-β1表達減弱而PLGF表達增強(P<0.05)。見表3。

2.6 葡萄胎組和GTN組患者TGF-β1與PLGF的相關(guān)性分析 TGF-β1與PLGF在葡萄胎組中表達呈中度負相關(guān)關(guān)系(r=-0.585，P<0.01); TGF-β1與PLGF在GTN組中表達呈中度負相關(guān)關(guān)系(r=-0.479，P=0.015)。

表2 TGF-β1和PLGF陽性表達率與葡萄胎惡變高危因素的關(guān)系

*Fisher’s exact probability method.

表3 TGF-β1和PLGF陽性表達率與GTN高危因素的關(guān)系

*Fisher’s exact probability method.

3 討 論

妊娠滋養(yǎng)細胞疾病是一類嚴重影響婦女身心健康的疾病，侵蝕性葡萄胎、絨毛膜癌和胎盤部位滋養(yǎng)細胞腫瘤統(tǒng)稱為GTN，侵蝕性葡萄胎基本都由葡萄胎惡變而來，絨毛膜癌可來源于葡萄胎、早產(chǎn)、足月產(chǎn)、異位妊娠及各種類型的流產(chǎn)等，其中葡萄胎來源約占50%。絨毛膜癌的惡性程度很高，而且具有高度親血管性，很早就可以發(fā)生全身廣泛轉(zhuǎn)移，在化療藥物問世以前，其死亡率>90%，隨著化療藥物的廣泛應(yīng)用，仍有20%的絨毛膜癌患者因?qū)熌退幎_不到痊愈[1-3]。目前，妊娠滋養(yǎng)細胞疾病的發(fā)生發(fā)展機制仍不十分明確，國內(nèi)外許多學(xué)者從基因表達譜和分子生物學(xué)水平來研究妊娠滋養(yǎng)細胞疾病的發(fā)生發(fā)展機制，TGF-β1和PLGF在妊娠期高血壓、宮頸癌等婦產(chǎn)科多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用；也有學(xué)者[4-7]發(fā)現(xiàn)：TGF-β1和PLGF在妊娠滋養(yǎng)細胞疾病的發(fā)生發(fā)展中也具有一定作用，該結(jié)論為妊娠滋養(yǎng)細胞疾病發(fā)病機制的研究提供了一個新的研究方向和靶點。

TGF-β1主要由胎盤通過自分泌和旁分泌方式分泌，其在妊娠胎盤絨毛細胞滋養(yǎng)層的細胞漿、絨毛附近及蛻膜組織等都有表達，在滋養(yǎng)細胞的生長分化、內(nèi)分泌和免疫功能等方面也有重要作用。正常妊娠胎盤需要足夠的胎盤血供，這就需要妊娠滋養(yǎng)細胞在蛻膜中正常增殖、遷移和浸潤，TGF-β1不僅可以影響子宮內(nèi)膜-滋養(yǎng)細胞的功能，還可以控制滋養(yǎng)細胞的浸潤，若TGF-β1表達異常，可通過抑制細胞外基質(zhì)的分解和下調(diào)滋養(yǎng)細胞的遷移能力，影響滋養(yǎng)細胞端粒酶活性，從而阻礙滋養(yǎng)細胞的增生、遷移、浸潤及正常胎盤血供的形成，導(dǎo)致病理性妊娠[4]。在參與滋養(yǎng)細胞侵入調(diào)節(jié)的細胞因子中，TGF-β1是目前研究最熱門的因子。本研究結(jié)果顯示：正常對照組TGF-β1陽性表達率高于葡萄胎組和GTN組， 葡萄胎組TGF-β1陽性表達率高于GTN組，與國外Bolat等[5]報道的研究結(jié)果一致。研究[6]顯示：TGF-β1在腫瘤發(fā)展過程中具有雙向調(diào)節(jié)的作用。在腫瘤早期，TGF-β1可抑制細胞過度增殖，促進細胞凋亡，從而阻止腫瘤的發(fā)生，妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤組織中TGF-β1表達減弱，可能因此導(dǎo)致抑制滋養(yǎng)細胞侵蝕能力減弱，抑制細胞外基質(zhì)溶解的作用也減弱，從而促進了滋養(yǎng)細胞的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移；在腫瘤晚期，腫瘤細胞自身會分泌大量TGF-β1，增強腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，進而轉(zhuǎn)變?yōu)榇龠M腫瘤細胞增殖和侵襲的物質(zhì)。劉紹晨等[7]通過JEG-3絨毛膜癌細胞體外實驗研究發(fā)現(xiàn)：外源性TGF-β1能夠促進絨毛膜癌細胞的增殖，增加其侵襲力，且表現(xiàn)出某種程度的濃度依附效應(yīng)。因此推測TGF-β1參與妊娠滋養(yǎng)細胞疾病發(fā)生發(fā)展的可能機制如下[8-11]：①影響細胞周期；②促使滋養(yǎng)細胞分化成侵襲能力較弱的合體滋養(yǎng)細胞；③使整合素表達升高，減少滋養(yǎng)細胞的遷移；④降低滋養(yǎng)細胞降解基底膜關(guān)鍵酶的活性，抑制纖維蛋白溶酶的表達，減少膠原酶合成；⑤抑制新生血管的形成，減少滋養(yǎng)細胞營養(yǎng)物質(zhì)的來源；⑥促進機體免疫細胞對滋養(yǎng)細胞的殺傷作用，減少滋養(yǎng)細胞的入侵。

PLGF是一種分泌型同源二聚體糖蛋白，是血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)家族中的一員，是由Maglione首次從人類妊娠胎盤cDNA文庫里分離純化出來的。mRNA的拼接方式不同可產(chǎn)生不同的蛋白亞型PLGF，不同蛋白亞型的PLGF可以通過與各自的受體特異性結(jié)合來介導(dǎo)內(nèi)皮細胞和基質(zhì)細胞作用，誘導(dǎo)血管生成，增加VEGF活性，從而發(fā)揮生物學(xué)作用[12]。1997年Vuorela等[13]首先證實PLGF主要來源于妊娠絨毛合體滋養(yǎng)層，其可以通過旁分泌和自分泌機制促進滋養(yǎng)細胞的增殖與分化，拮抗內(nèi)皮細胞凋亡，增強血管的通透性，促進血管生長。PLGF在白細胞浸潤、內(nèi)皮細胞生長及遷移、基質(zhì)細胞遷移、血管形成、缺血組織血管再通、胎盤絨毛膜的血管形成和腫瘤生長等多方面都有重要作用[16]。研究[17]顯示：PLGF蛋白在正常妊娠婦女血清中，4～14周呈低水平表達，15～25周表達水平迅速上升，26～30周表達水平達最高峰，31周后表達水平明顯下降。在正常未孕女性和男性血清中檢測不到PLGF(7 ng·L-1)，在病理狀態(tài)下(外傷、腫瘤和炎癥反應(yīng)等)PLGF是血管生成的關(guān)鍵因子[16]。本研究結(jié)果顯示：正常對照組研究對象PLGF陽性表達率低于葡萄胎組和GTN組；葡萄胎組PLGF陽性表達率低于GTN組，與李潤花等[17]報道的結(jié)果一致。Oranratanaphan等[18]的研究也得出了類似的結(jié)果。De Falco等[19]的體外實驗亦證實：阻止PLGF與其受體結(jié)合，可以增加滋養(yǎng)細胞的凋亡率。PLGF參與妊娠滋養(yǎng)細胞疾病發(fā)生發(fā)展的可能作用機制[20-23]：①PLGF與其受體結(jié)合后影響滋養(yǎng)細胞的增生和分化，導(dǎo)致滋養(yǎng)細胞惡性轉(zhuǎn)化；②PLGF促進新生血管形成和血管生長，促進滋養(yǎng)細胞增殖浸潤；③PLGF與其受體結(jié)合后能誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，而炎癥介質(zhì)浸潤是腫瘤生長和血管形成的良好環(huán)境，炎性因子還可以活化致癌基因、降解抑癌基因，從而促進妊娠滋養(yǎng)細胞疾病的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，TGF-β1和PLGF的陽性表達與葡萄胎惡變高危因素有關(guān)，提示TGF-β1的低表達而PLGF高表達可能有助于預(yù)測葡萄胎惡變；TGF-β1和PLGF的陽性表達與GTN的臨床分期也有關(guān)，提示TGF-β1低表達而PLGF高表達可能有助于了解GTN進展，判斷GTN的預(yù)后并指導(dǎo)化療。本研究針對TGF-β1與PLGF在葡萄胎及妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤中相關(guān)性進行了研究，在葡萄胎組及GTN組中TGF-β1與PLGF陽性表達均呈負相關(guān)關(guān)系，其原因可能是TGF-β1表達減弱，其對滋養(yǎng)細胞增生、轉(zhuǎn)移和浸潤能力的抑制作用減弱，同時低水平的TGF-β1還可促進新生血管形成，增加滋養(yǎng)細胞營養(yǎng)物質(zhì)來源，因此細胞分泌PLGF增多，進而又可以促進滋養(yǎng)細胞異常增生和分化，介導(dǎo)新生血管及其分支形成，因而低水平的TGF-β1協(xié)同高水平PLGF對妊娠滋養(yǎng)細胞疾病的發(fā)生發(fā)展起促進作用。但關(guān)于TGF-β1和PLGF在妊娠滋養(yǎng)細胞疾病中的具體作用機制仍有待進一步研究。