趙振理，暢繼武，孫 光，胡少華

(1.海南省婦幼保健院泌尿外科，海南 ?？?571199；2.天津市泌尿外科研究所腫瘤免疫研究所，天津 300202)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，具體發(fā)病機制尚不明確，基因水平的研究提示膀胱癌的發(fā)生發(fā)展可能與基因的異常表達有關(guān)。研究者從基因水平對膀胱癌進行研究，在膀胱癌組織中發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶P1(glutathione S-transferase pi-1,GSTP1)的一個特異性突變體。GSTP1屬于谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)基因家族中的一種，在膀胱癌中有較高水平的表達，而在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的基因庫中尚未發(fā)現(xiàn)有該突變體，因此本文作者將其提交至NCBI獲取基因號：AY887902，蛋白號：AAX14401，并進一步制備AAX14401抗體Anti-AY[1-2]。為了進一步對AAX14401蛋白在膀胱癌中的作用進行研究，本研究對AAX14401蛋白在膀胱癌組織中的表達情況進行分析，闡明該突變體在膀胱癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，為膀胱癌患者早期積極干預(yù)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集2004—2005年天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科術(shù)后存檔蠟塊中膀胱移行細胞癌標(biāo)本75例。其中男性55例，女性20例；年齡43～79歲，中位年齡63.3歲。所有患者均有詳細的臨床資料，且術(shù)前均未進行化療或放療，術(shù)后有明確的病理學(xué)診斷結(jié)果。采用世界衛(wèi)生組織(WHO)病理分級標(biāo)準(zhǔn)進行分級：Ⅰ級11例，Ⅱ級48例，Ⅲ級16例。選取標(biāo)本時，從12例因良性前列腺增生(BPH)行開放手術(shù)的患者中取正常膀胱黏膜作為對照組。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，且所有實驗研究均有患者知情同意授權(quán)。

1.2 主要試劑 GSTP1(一抗)、免疫組織化學(xué)試劑盒(SP)和DAB顯色試劑盒購自上海長島生物公司，Anti-AY(一抗)由上海午立公司協(xié)助制備。

1.3 實驗過程和染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 切取厚度約4 μm的石蠟包埋組織切片，常規(guī)脫蠟、水化、滅活內(nèi)源性酶活性，熱抗原修復(fù)后，按照免疫組織化學(xué)試劑盒說明進行操作，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明劑封片。GSTP1陽性染色為胞質(zhì)著色，呈淺黃至棕黃色顆粒，根據(jù)胞質(zhì)的染色程度分為：細胞質(zhì)未染色(-)，細胞質(zhì)呈淺黃色(+)，細胞質(zhì)呈棕黃色()。AAX14401蛋白陽性染色為胞質(zhì)和胞核著色，呈淺黃至棕黃色顆粒。根據(jù)胞質(zhì)的染色程度分為：胞質(zhì)和胞核不著色(-)，胞質(zhì)和胞核呈淺黃色(+)，胞質(zhì)和胞核呈棕黃色()。所有閱片均由病理科2位主任醫(yī)師獨立完成。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。GSTP1和AAX14401蛋白在正常膀胱組織和膀胱癌組織中陽性表達率以及在膀胱癌不同分級間陽性表達率的比較均采用秩和檢驗；GSTP1和AAX14401蛋白在膀胱癌組織中表達情況的相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同組織中GSTP1免疫組織化學(xué)染色 膀胱癌組織GSTP1染色結(jié)果呈陰性、染色程度“+”和“”者可見胞質(zhì)染成棕黃色(圖1A～C，見插頁五)；正常膀胱組織GSTP1染色呈陰性、染色程度“+”者可見胞質(zhì)染成淺黃色(圖1D和E，見插頁五)。

2.2 不同組織中AAX14401蛋白免疫組織化學(xué)染色 膀胱癌組織AAX14401蛋白染色結(jié)果呈陰性、染色程度“+”和“”者可見胞質(zhì)和胞核均有棕黃色著色(圖2A～C，見插頁五)；正常膀胱組織AAX14401蛋白染色結(jié)果均呈陰性(圖2D，見插頁五)。

2.3 GSTP1和AAX14401蛋白在膀胱癌組織中表達情況 在膀胱癌組織中，GSTP1和AAX14401蛋白并無同為陽性表達者。膀胱癌組織中，GSTP1蛋白陽性表達率為90.7%，而AAX14401蛋白陽性表達率為2.7%。見表1。

表1 GSTP1和AAX14401蛋白在膀胱癌組織中的表達

Tab.1 Expressions of GSTP1 and AAX14401 proteins in bladder cancer tissue

Expression of GSTP1Expression of AAX14401 -+Total-5117+160016520052Total731175

2.4 GSTP1和AAX14401蛋白在正常膀胱組織中的表達情況 GSTP1在正常膀胱組織中陽性表達率為58.3%(7/12)，而AAX14401蛋白在正常膀胱組織中均未表達。

2.5 膀胱癌組織和正常膀胱組織中GSTP1和AAX14401蛋白表達情況 秩和檢驗結(jié)果顯示：GSTP1在膀胱癌組織和正常膀胱組織中陽性表達率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，其在低級別(病理分級為Ⅰ和Ⅱ級)膀胱癌組織中表達水平和病理分級呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.735,P<0.01)，但其在Ⅲ級膀胱癌組織中表達水平下降，推測可能是GSTP1出現(xiàn)了失活或突變。AAX14401蛋白在膀胱癌組織和正常膀胱組織中陽性表達率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.596)。

2.6 膀胱癌組織中GSTP1和AAX14401蛋白表達的相關(guān)性 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示：GSTP1和AAX14401蛋白在膀胱癌組織中的表達呈負相關(guān)關(guān)系(r=-0.274，P=0.018)。

3 討 論

膀胱癌作為泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)逐年升高[3]，但具體發(fā)病機制目前仍不清楚。隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展，學(xué)者開始從基因水平對膀胱癌進行研究。為了從基因水平對膀胱癌進行研究，本課題組前期通過對正常膀胱組織與膀胱移行細胞癌組織進行抑制消減雜交文庫的構(gòu)建，獲取了一條特異性的表達序列標(biāo)簽(EST)片段。對該EST片段進行全長擴增及生物信息學(xué)分析，提交至NCBI獲取基因號(AY887902)和蛋白號(AAX14401)，進一步分析發(fā)現(xiàn)AY887902是GSTP1的突變體[2]。

GSTP1屬于GSTs基因家族中的一種，主要在人類組織中表達。GSTs的表達水平與腫瘤的耐藥性有密切關(guān)系，作為在腫瘤細胞中最常見表達的GSTP1，可見于大多數(shù)的耐藥細胞中。相關(guān)研究[4-5]證實：GSTP1的表達異常升高會使腫瘤對順鉑等治療藥物有較強的解毒能力，從而表現(xiàn)出對藥物的耐受性。

GSTP1在膀胱癌、肺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌和乳腺癌等組織中陽性表達率明顯高于相應(yīng)的正常組織，并且腫瘤惡性程度越高，GSTP1表達水平越強[6-10]。有學(xué)者通過研究GSTP1在膀胱癌中的表達情況，發(fā)現(xiàn)GSTP1在膀胱癌中有較高水平的表達，并且其表達水平隨著膀胱癌病理分級的升高而增強，提示GSTP1可能與癌細胞的凋亡機制相關(guān)[11-14]。本研究對不同病理分級的膀胱癌組織GSTP1表達情況進行對比分析，結(jié)果顯示：GSTP1在低級別(病理分級為Ⅰ和Ⅱ級)膀胱癌組織中表達水平與病理分級呈正相關(guān)關(guān)系，在Ⅲ級膀胱癌組織中表達水平下降，這與Pljesa-Ercegovac等[14]的研究結(jié)果有所差異。但本實驗結(jié)果與臨床實踐相吻合，即腫瘤惡性度越高，對化療藥物的敏感性越強[15-16]。

Gao等[17]研究發(fā)現(xiàn)：GSTP1可以抑制膀胱癌細胞的增殖，提示GSTP1可能是一種抑癌基因。本研究對正常膀胱組織和膀胱癌組織GSTP1和AAX14401蛋白的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：GSTP1基因出現(xiàn)突變，并形成AY887902；而AY887902是失功能的突變體，并且僅存在于膀胱癌組織中。因此本文作者推測GSTP1突變失活后導(dǎo)致了膀胱癌的惡化。Berendsen等[18]對膀胱癌組織、癌旁正常組織和正常膀胱組織中GSTP1蛋白表達情況進行分析結(jié)果顯示：膀胱癌的發(fā)生可能與GST/GSH系統(tǒng)的活性較低有關(guān)。因此本文作者認為：本實驗中病理分級Ⅲ級的膀胱癌組織中GSTP1蛋白表達水平較低，可能與GSTP1的失活或突變有關(guān)。

綜上所述，AAX14401蛋白的出現(xiàn)可能是膀胱癌惡化的一個標(biāo)志，因此提示如果能夠早期在膀胱癌組織中發(fā)現(xiàn)AAX14401蛋白，則可以對膀胱癌患者采取更加積極的治療措施。