陳炳鵬, 任 明, 李容杭, 韓 青, 王金成

(吉林大學第二醫(yī)院骨科, 吉林 長春 130041)

骨肉瘤是一種最常見的組織學原發(fā)性骨腫瘤，常發(fā)于青少年人群中。盡管近年來包括化療和手術治療在內的現(xiàn)代多學科治療方法都在不斷的發(fā)展，骨肉瘤患者的5年生存率仍然只是維持在60%～70%[1-2]。最近隨著腫瘤相關信號通路和新型基因靶向治療的研究進展，為預防和治療骨肉瘤提供了新的策略和途徑。目前與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展相關的關鍵基因包括FAS、Ezrin、CXCR4、COX-2、HER2、以及NOTCH和HES1等[3-5]。但是仍缺乏一個能準確預測骨肉瘤進展、轉移和對化療反應性的標志性分子。NOB1蛋白是26S蛋白酶體的一個亞單位，在蛋白酶功能和RNA代謝過程中發(fā)揮重要作用。研究[6-10]顯示：NOB1在多種腫瘤中異常表達且發(fā)揮重要功能。但是,NOB1在骨肉瘤中的功能及其分子機制尚不十分清楚。本研究應用慢病毒介導的短發(fā)夾RNA(short hourpin RNA,shRNA)干擾技術建立抑制NOB1 mRNA表達的Lv-shNOB1-U2OS骨肉瘤細胞株，利用mRNA表達譜芯片對Lv-shCon-U2OS組和Lv-shNOB1-U2OS組細胞分別行表達譜分析，篩選出可能受NOB1調控的基因，并對差異基因進行相關分析，為進一步研究NOB1在骨肉瘤中的功能奠定分子基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞株、主要試劑和儀器 Lv-shNOB1-U2OS細胞株及其相應的對照細胞Lv-shCon-U2OS細胞株由本課題組建立。RNA LabChip○Rkits、RNA 6000 nano marker、表達譜芯片配套試劑盒、Gene Expression Hybridization Kit和Gene Expression Wash Buffer Kit均購自美國Agilent Technologies公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司, 胰蛋白酶和胎牛血清購自美國Invitrogen公司。NanoDrop ND-2000和載物片洗缸為美國Thermo公司產品，Agilent Bioanalyzer 2100生物分析儀、雜交爐和Agilent Scanner G2505C為美國Agilent Technologies公司產品。Feature Extraction軟件version 10.7.1.1和Genespring軟件version 12.5為美國Agilen Technologies公司產品。

1.2 定量PCR法檢測人NOB1基因的干擾效率 提取感染重組病毒Lv-shNOB1-U2OS細胞、感染空病毒Lv-shCon-U2OS細胞、未感染病毒的Saos-2細胞和U2OS細胞的總RNA，以總RNA為模板，β-actin為內參照，用定量PCR法檢測細胞中NOB1 mRNA表達變化。Real-time PCR引物采用Primer Premier 5.0設計，送上海生工公司合成。引物序列如下：NOB1，上游引物 5′-GAAAGAACAACGCCCTGGAG-3′；下游引物 5′-CAGCCTTGAGATGACCTAAGC-3′；β-actin， 上游引物 5′-GTGGACATCCGCAAAGAC-3′；下游引物 5′-AAAGGGTGTAACGCAACTA-3′。

1.3 RNA提取及逆轉錄 當細胞生長至95%融合度后，用無菌細胞刮分別刮取實驗組和對照組的貼壁細胞；按照Trizol reagent試劑盒說明書提取RNA；應用QIAGEN RNeasy Mini Kit純化質檢合格的總RNA；按照標準流程應用Agilent表達譜芯片配套試劑盒對純化后的總RNA中的mRNA進行放大和標記。

1.4 基因芯片的制備 按Gene Expression Hybridization Kit說明書，采用如下比例配置混合液：Cy3標記的線性擴增的cRNA樣品5 μg，10× Gene Expression Blocking Agent 50 μL，25×Fragmentation Buffer 10 μL,Nuclease-free water 補齊體系總體積至250 μL；60℃水浴孵育混合液30 min，冰上淬冷1 min；加入250 μL 2× Hi-RPM Hybridization Buffer終止RNA裂解，吹打混勻。然后13 000×g離心1 min，將樣品置于冰上并立刻上樣；在載玻片的上樣孔中滴加490 μL樣品，蓋上芯片并將芯片置于雜交盒中，雜交爐中65℃滾動雜交17 h。應用基因表達洗滌緩沖液試劑盒(Gene Expression Wash Buffer Kit)對芯片進行洗滌。

1.5 芯片掃描 所用芯片為Agilent Human Gene Expression (8*60K，Design ID:039494)。洗滌后的芯片通過Agilent Scanner G2505C進行掃描。染色通道為Green，掃描分辨率3 μm, 20bit。采用配套軟件Feature Extraction(version 10.7.1.1)讀取原始數(shù)據(jù)，采用Genespring軟件(version 12.5)以及Quantile算法進行歸一化處理，得到每個基因在各樣品中的相對含量。

1.6 數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計學方法 應用GenBank(http://www.ncbi.nlm. nih. gov/genbank/)全庫對基因芯片所得表達譜數(shù)據(jù)進行注釋，對應蛋白產物注釋應用Swissport/UniProt(http://web.expasy.org/docs/swiss-prot_guideline.html)全庫。Lv-shNOB1-U2OS組和Lv-shCon-U2OS組兩兩配對做3個生物學重復。差異基因的篩選采用SPSS 10.0軟件進行配對t檢驗和SAM運算。首先對差異基因進行生物信息學數(shù)據(jù)庫腫瘤基因GO注釋，然后將差異基因向Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(http://www.geneontology.org/)的GO條目進行映射，從而得到各GO條目的差異基因數(shù)。進一步利用SPSS10.0軟件進行超幾何檢驗，找出差異基因明顯富集的GO條目。同樣，采用與GO富集相似的方法對通路(pathway)進行富集，將差異基因向京都基因與基因組百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫(http://www.genome.jp/kegg/)中的通路進行映射，再采用超幾何檢驗找出差異基因明顯富集的通路條目。

2 結 果

2.1 NOB1干擾效率檢測 采用q-PCR法檢測慢病毒載體干擾效率。在骨肉瘤細胞系U2OS中，NOB1 shRNA均能有效抑制NOB1的表達。與Lv-shCon組和Con組比較，干擾效率均大于50%，而Lv-shCon組與Con組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 通過Lv-shNOB1慢病毒載體轉染成功構建了Lv-shNOB1-U2OS細胞株及相應的對照Lv-shCon-U20s細胞株。

2.2 差異表達譜分析 在篩選差異基因之前，先進行探針過濾，用于比較的每組樣本中至少有一組100%標記為Detected的探針留下進行后續(xù)分析。利用差異倍數(shù)Fold change值進行篩選，標準為Fold change值≥2.0。本研究對歸一化后的芯片數(shù)據(jù)進行了差異表達分析，單熒光芯片的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過標準化處理，轉化為log以2為底的對數(shù)后，在一個二維直角坐標系平面中，繪制散點圖。芯片數(shù)據(jù)的散點圖常用于評估2組數(shù)據(jù)總體分布集中趨勢。

從基因芯片代表性熒光雜交信號散點圖(圖1)可看出，在2個實驗組間存在大量基因mRNA表達差異高于2倍，顯示出極大的表達譜改變。NOB1干擾后共有792個基因mRNA表達水平上調以及1 059個基因mRNA表達水平下調，總共差異變化基因為1 851個。

2.3 基因功能的GO分析 本研究設定超幾何檢驗所得P值小于0.05作為差異基因明顯富集的篩選指標。分別從細胞位置(cellular component)、分子功能(molecular function)以及生化過程(biological_process)3個一級條目對所有差異基因進行富集分析。

從細胞位置條目的富集程度(圖2)來看，差異基因編碼產物蛋白主要分布于細胞質膜，占56.9%；分布于細胞外區(qū)域的占39.4%；分布于細胞外空間占20%；其他所分布區(qū)域按比例由大到小依次為蛋白質的細胞外基質、細胞外間質、細胞質膜、基底膜、膠原蛋白、核小體、血小板和肌球蛋白。

從分子功能條目的富集程度(圖3)來看，差異基因編碼產物蛋白主要功能為鈣離子結合相關功能，占總差異基因的22%； 其次功能為轉運子活性，占總差異基因的9.2%； 第3位功能為肌動蛋白結合活性，占總差異基因的8.7%。

從生化過程條目的富集程度(圖4)來看，差異基因編碼產物蛋白主要參與過程為信號轉導，占總差異基因的18.7%；其次參與過程為多種細胞器生成，占總差異基因的15.6%；第3位過程為細胞黏附過程，占總差異基因的10.2%。

圖2 差異基因的亞細胞位置分布

圖3 差異基因的分子功能分布

Fig.3 Distribution of molecular function of differential genes

2.4 差異基因通路富集KEGG分析 利用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異基因進行Pathway分析，找到富集差異基因的Pathway 條目，尋找不同樣品的差異基因可能與哪些細胞通路的改變有關。對于KEGG數(shù)據(jù)庫，滿足條件的差異基因富集條目有上百個之多，這可能是由于KEGG數(shù)據(jù)庫收錄了大量正常代謝和生化途徑相關通路，這些通路涵蓋基因數(shù)過多造成的。在此本文作者選擇性的列出富集程度前12的通路。由圖5可知，差異基因在系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關通路(systemic lupus erythematosus)所占總差異基因的比例最大，為24.5%，其次主要分布的通路為細胞因子-細胞因子受體相互作用通路(cytokine-cytokine receptor interaction)和細胞的焦點黏連( focal Adhesion)信號通路，分別占總差異基因的19.4%和16.3%。

圖4 差異基因在生物學進程中的富集情況

Fig.4 Enrichment of differential genes in biological process

圖5 KEGG數(shù)據(jù)庫中差異基因富集程度通路

Fig.5 Enrichment degree pathways of differential genes in KEGG database

3 討 論

NOB1基因Nob1p(Nin one binding protein)蛋白最早通過利用酵母雙雜交方法在酵母中鑒定為一種鋅帶蛋白，其在溶酶體的組裝和成熟以及對于核糖體RNA (ribonsomal RNA, rRNA)的形成過程中發(fā)揮著重要的作用[11-12]。NOB1是一個與細胞周期及轉錄相關的基因，雖然關于NOBl在腫瘤方面的研究還很有限，其在腫瘤中的功能機制也并未明確，鑒于NOB1在UPP途徑和核糖體合成過程中的重要作用，NOB1基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用越來越受到重視[13-15]。

本研究利用mRNA表達譜芯片對Lv-shCon-U2OS組和Lv-shNOB1-U2OS組細胞分別行表達譜分析，結果顯示：NOB1干擾后共有792個基因mRNA表達水平上調，1 059個基因mRNA表達水平下調，總共差異變化基因為1 851個。上調基因數(shù)和下調基因數(shù)相仿，整體差異基因數(shù)較多，說明NOB1干擾后影響的表達譜范圍較廣，預示NOB1在骨肉瘤細胞中可能具有重要的功能。本研究分別從細胞位置、分子功能以及生化過程3個一級條目對所有差異基因進行GO分析。細胞質膜是指包圍在細胞表面的一層極薄的膜，主要由膜脂和膜蛋白所組成。質膜的基本作用是維護細胞內微環(huán)境的相對穩(wěn)定，并參與同外界環(huán)境進行物質交換、能量和信息傳遞。另外，細胞質膜在腫瘤細胞的生存、生長、分裂和分化中起重要作用。細胞受體能與細胞外專一信號分子(配體)結合引起細胞反應的蛋白質，可分為細胞表面受體和細胞內受體。受體與配體結合即發(fā)生分子構象變化，從而引起細胞反應，如介導細胞間信號轉導、細胞間黏合和細胞胞吞等細胞過程[16]。細胞信號轉導是指細胞外因子通過與受體(膜受體或核受體)結合，引發(fā)細胞內的一系列生物化學反應以及蛋白間相互作用，直至細胞生理反應所需基因開始表達、各種生物學效應形成的過程。細胞信號轉導是一個十分復雜的網(wǎng)絡系統(tǒng)，對腫瘤細胞的各個方面都有極其重要的影響[17]。

本研究利用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異基因進行Pathway分析，結果顯示：差異基因在系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關通路所占總差異基因的比例最大；其次主要分布的通路為細胞因子-細胞因子受體相互作用通路和細胞的焦點粘連信號通路。 其中，細胞的許多重要功能均由細胞因子介導，細胞因子通過特定的細胞表面受體激活相關信號通路，并在細胞內發(fā)揮作用以協(xié)調生物反應，其中比較熱門的相關通路有JAK/STAT通路(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription)[18-19]、MAPK通路(mitogen-activated protein kinases)[20]和核因子κB(NF-κB)信號通路等。JAK/STAT通路、MAPK通路以及NF-κB信號通路作為應激反應通路，對胞內或胞外的多種刺激做出反應，調節(jié)細胞內增殖、分化、凋亡以及炎癥反應等多種重要生物學過程的發(fā)生[21-22]。

綜上所述，本研究闡明了NOB1在骨肉瘤中的重要作用，提示NOB1可能參與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展和轉移過程。本研究為骨肉瘤的基因靶向治療提供了新的具有潛力的治療靶點。