盧澤潮 唐福才 何燁 李志標(biāo) 雷漢祺 黃偉娜 何朝輝

腎細(xì)胞癌是腎臟最常見的惡性腫瘤，大約占成人惡性腫瘤的4%。近年來腎細(xì)胞癌的發(fā)病率和死亡率都有所上升[1]，其中70%～80%的患者為腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)[2]。ccRCC早期診斷困難，約30%～50%的患者確診時(shí)已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移[3]。Ⅲ期和Ⅳ期腎細(xì)胞癌患者預(yù)后差，5年生存率僅有50%和10%[4-5],同時(shí)轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌對放療和化療不敏感[6]。因此，對ccRCC發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移機(jī)制進(jìn)行研究，將有利于ccRCC的臨床診斷和治療。

隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展及芯片和測序技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用， GEO(Gene Expression Omnibus)和TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫中積累了豐富的不同疾病的基因組和基因表達(dá)譜，為研究包括腫瘤在內(nèi)的各種疾病的分子發(fā)病機(jī)制提供了新思路。本研究對GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫中與ccRCC相關(guān)的芯片和測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了差異基因篩選，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，包括通路富集、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)分析和生存分析，旨在為ccRCC分子機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。

對象與方法

一、數(shù)據(jù)下載

本文從GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載ccRCC mRNA表達(dá)譜芯片GSE53757，該數(shù)據(jù)集有144個樣本，其中包括72例ccRCC及72例正常腎臟組織。同時(shí)從TCGA(http://cancergenome.nih.gov/) 數(shù)據(jù)庫下載610例ccRCC的RNA測序數(shù)據(jù)，其中包括538例ccRCC以及72例癌旁組織作為對照。

二、差異表達(dá)基因篩選

利用R語言的limma包和edgeR包分別對GEO芯片和TCGA測序數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因篩選。差異倍數(shù)的變化闕值設(shè)為2，P值為0.05。兩個數(shù)據(jù)庫中篩選出來的差異基因結(jié)果取交集，獲得共同的差異基因，并繪制火山圖和韋恩圖。

三、功能富集和PPI網(wǎng)絡(luò)分析

利用metascape(http://metascape.org)在線分析網(wǎng)站對上述共同差異表達(dá)基因進(jìn)行功能和通路富集，利用STRING網(wǎng)站進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析。并將所有的差異基因?qū)隒ytoscape軟件進(jìn)行可視化和模塊分析。

四、生存分析

通過構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出關(guān)鍵基因，并利用OncoLnc(http://www.oncolnc.org/)網(wǎng)站對關(guān)鍵基因進(jìn)行生存分析。

結(jié) 果

一、ccRCC差異表達(dá)基因的篩選

GEO數(shù)據(jù)庫中的基因篩選結(jié)果顯示，ccRCC的上調(diào)差異基因有567個，下調(diào)差異基因有531個。TCGA數(shù)據(jù)庫中的基因篩選結(jié)果顯示，ccRCC的上調(diào)差異基因有1 830個，下調(diào)差異基因有558個。在兩個數(shù)據(jù)庫中共同表達(dá)上調(diào)的差異基因有326個，共同表達(dá)下調(diào)的差異基因有334個。根據(jù)基因篩選結(jié)果繪制的火山圖和韋恩圖見圖1。

A:GEO數(shù)據(jù)庫的火山圖;B:TCGA數(shù)據(jù)庫的火山圖;C:韋恩圖

圖1 差異基因火山圖和韋恩圖(紅色和綠色斑點(diǎn)代表差異基因，紅色：上調(diào); 綠色：下調(diào))

二、差異表達(dá)基因的通路與功能富集

利用metascape對326個共同上調(diào)和334個共同下調(diào)的差異基因進(jìn)行通路富集分析，并按P值大小排列，結(jié)果顯示差異表達(dá)基因主要富集在白細(xì)胞遷移、細(xì)胞黏附調(diào)節(jié)及免疫應(yīng)答正調(diào)節(jié)等通路。見圖2。

三、PPI網(wǎng)絡(luò)分析

取交集后的660個差異基因，利用STRING網(wǎng)站進(jìn)行PPI分析，并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)和兩個重要的模塊。見圖3。同時(shí)對PPI網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行得分計(jì)算，得到位列前15的差異基因，分別是VEGFA、EGF、CD86、ITGAM、CCL5、TYROBP、CCR5、KNG1、CXCR4、CD2、ITGB2、LILRB2、CXCL10、MMP9和CXCL9。

圖2 通路與功能富集結(jié)果

A:PPI網(wǎng)絡(luò);B:來自PPI網(wǎng)絡(luò)的模塊1;C:來自PPI網(wǎng)絡(luò)的模塊2

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)和兩個重要的模塊(紅色節(jié)點(diǎn)表示上調(diào)的差異基因，綠色節(jié)點(diǎn)表示下調(diào)的差異基因)

四、生存分析

為了進(jìn)一步探究排名前15的關(guān)鍵基因的臨床意義，利用OncoLnc對這15個基因進(jìn)行生存分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCL5(P=0.000 31)、TYROBP(P=0.004 68)、LILRB2(P=0.002 71)和MMP9(P=0.000 85)4個基因的表達(dá)量與患者的生存率密切相關(guān)。Kaplan-Meier曲線顯示CCL5、TYROBP、LILRB2和MMP9低表達(dá)的患者與高表達(dá)的患者相比，有更高的生存率。見圖4。

討 論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展往往伴隨著多個基因的參與。隨著生物芯片和高通量測序技術(shù)的發(fā)展，人們可以運(yùn)用生物信息學(xué)方法從全基因組的角度，對與腫瘤相關(guān)的基因進(jìn)行深入的研究。本研究基于對GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫的挖掘，結(jié)合生物信息學(xué)，篩選出660個差異基因。通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析，在660個差異基因中篩選出起重要作用的關(guān)鍵基因，包括VEGFA、EGF、CD86、ITGAM、CCL5、TYROBP、CCR5、KNG1、CXCR4、CD2、ITGB2、LILRB2、CXCL10、MMP9及CXCL9。生存分析表明，CCL5、TYROBP、LILRB2和MMP9的表達(dá)量與患者的生存率密切相關(guān)。其中文獻(xiàn)檢索和生存分析表明，TYROBP和LILRB2可能是與ccRCC相關(guān)的潛在關(guān)鍵基因。

A:CCL5;B:TYROBP;C:LILRB2;D:MMP9

圖4 Kaplan-Meier曲線

660個差異表達(dá)基因中上調(diào)基因326個，下調(diào)基因334個。為進(jìn)一步研究差異基因的功能，本文利用metascape進(jìn)行了功能富集分析。結(jié)果顯示差異基因主要富集在白細(xì)胞遷移和細(xì)胞黏附調(diào)節(jié)等通路。在人體自我防御中，白細(xì)胞遷移是先天性免疫必不可少的部分。在腫瘤治療中，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的遷移能力，可以促進(jìn)其向腫瘤微環(huán)境歸巢，從而增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的抗腫瘤作用。Kremer等[7]的研究表明，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞表面趨化因子受體CXCR2的表達(dá)，可以促進(jìn)自然殺傷細(xì)胞的遷移能力，提高對腎細(xì)胞癌癌細(xì)胞的殺傷力。提示監(jiān)測和增強(qiáng)白細(xì)胞遷移通路，對ccRCC的治療具有重要的意義。細(xì)胞黏附是指細(xì)胞之間的黏附，是細(xì)胞生理活動必需的，細(xì)胞黏附能力的增強(qiáng)或改變是導(dǎo)致腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要因素[8]。研究表明，上皮細(xì)胞黏附分子可以作為ccRCC的獨(dú)立預(yù)后因子[9]，血管細(xì)胞黏附分子1是一種黏附分子，具有作為ccRCC標(biāo)志物的臨床價(jià)值[10]。上述研究均表明細(xì)胞黏附可以作為ccRCC診斷或預(yù)后的關(guān)鍵通路。

利用篩選出的660個差異基因構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并計(jì)算網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的得分，由高到低排列，篩選出在ccRCC中最關(guān)鍵的15個基因。已有文獻(xiàn)[11-21]報(bào)道VEGFA、EGF、CD86、CCR5、KNG1、CXCR4、CD2、CXCL10、MMP9和CXCL9基因與腎癌關(guān)系密切。OncoLnc的生存分析顯示，CCL5、TYROBP、LILRB2和MMP9表達(dá)量的高低與患者的生存率密切相關(guān)(P<0.05)。提示CCL5、TYROBP、LILRB2和MMP9可能在ccRCC的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用，并且可能具有潛在的臨床診斷和治療價(jià)值。

有研究[22]指出將T細(xì)胞和腎癌細(xì)胞共同培養(yǎng)，將刺激產(chǎn)生更多的CCL5因子。但是在腎癌中的具體調(diào)控機(jī)制不詳。TYROBP是存在于自然殺傷細(xì)胞內(nèi)的多種活化性受體的調(diào)節(jié)性蛋白，起激活小膠質(zhì)細(xì)胞識別和吞噬神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞作用[23]。但是目前國內(nèi)外尚無TYROBP與ccRCC相關(guān)研究的文獻(xiàn)報(bào)道。同樣，也未發(fā)現(xiàn)LILRB2與腎細(xì)胞癌相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，可作為腎細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的潛在基因做進(jìn)一步研究。LILRB2主要表達(dá)于骨髓細(xì)胞和B細(xì)胞，起抑制免疫應(yīng)答的作用，其在非小細(xì)胞肺癌中的高表達(dá)與患者的預(yù)后不良相關(guān)[24]。LILRB2與其配體ANGPTL2的自分泌信號在胰腺癌前病變的早期轉(zhuǎn)移行為中起關(guān)鍵作用，提示其在胰腺導(dǎo)管腺癌早期檢測、轉(zhuǎn)移和治療中的作用[25]。但在ccRCC方面，未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文生存分析結(jié)果顯示，TYROBP、LILRB2基因低表達(dá)的患者，生存率要明顯高于LILRB2、TYROBP基因高表達(dá)的患者。提示TYROBP和LILRB2可能對ccRCC的診斷、治療以及預(yù)后評價(jià)具有重要的意義，但仍然需做進(jìn)一步的研究，探究其在ccRCC中的作用。MMP9涉及多個階段的癌癥進(jìn)展，包括侵襲和轉(zhuǎn)移[26]。研發(fā)針對MMP9的抑制劑或許能成為抑制ccRCC侵襲和轉(zhuǎn)移的新思路。

綜上所述，本文運(yùn)用生物信息學(xué)方法，篩選得到ccRCC與正常組織之間的差異基因，并篩選出相關(guān)的通路。同時(shí)對差異基因行進(jìn)一步篩選，得到包括LILRB2在內(nèi)的15個關(guān)鍵基因。這些關(guān)鍵基因可能在ccRCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，但具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探討，這對于ccRCC的診斷、治療以及預(yù)后具有極大的臨床意義。