羅雄燕，袁佳莉，羅采南，劉 靜，武麗君，陳 勇，袁國華，劉 毅

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是由患者機(jī)體產(chǎn)生多種自身抗體并由此介導(dǎo)組織和器官損傷而導(dǎo)致的一種自身免疫性疾病。在SLE造成的損害中，血小板減少為常見臨床表現(xiàn)之一，部分患者可因嚴(yán)重血小板減少而造成致命性出血性疾病[1]。研究顯示，SLE伴發(fā)血小板減少與患者存在抗血小板抗體導(dǎo)致的血小板破壞有關(guān)。筆者既往研究發(fā)現(xiàn)，SLE伴發(fā)血小板減少患者存在骨髓巨核細(xì)胞功能異常[2]，促血小板生成素(thrombopoietin，TPO)在維持骨髓巨核細(xì)胞的功能中發(fā)揮作用。本文通過對SLE伴發(fā)血小板減少患者血清TPO水平及抗TPO抗體產(chǎn)生情況進(jìn)行研究，探討TPO及其抗體在SLE伴發(fā)血小板減少中的作用。

1 材料與方法

1.1 對象

2016年3月至2017年5月在四川大學(xué)華西醫(yī)院、川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院、新疆自治區(qū)人民醫(yī)院、四川省簡陽市人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科住院治療的SLE患者213例，根據(jù)患者是否伴血小板減少分為SLE伴血小板減少組和SLE血小板正常組。SLE伴發(fā)血小板減少組61例，其中并發(fā)嚴(yán)重感染、腫瘤、腎功能不全者8例，另有3例血小板減少者不能排除藥物因素的影響，該11例患者被排除。實(shí)際納入SLE伴發(fā)血小板減少者50例，包括男4例，女46例?；颊吣挲g13～61歲，平均34.1歲；病程0.5～181個(gè)月，中位病程35.4個(gè)月。SLE血小板正常組43例，男4例，女39例，年齡11～57歲，平均32.7歲；病程0.5～172個(gè)月，中位病程31.8個(gè)月。2組患者均符合1997年ACR的SLE診斷分類標(biāo)準(zhǔn)[3]。詳細(xì)收集SLE患者的臨床資料，并按文獻(xiàn)報(bào)道的方法計(jì)算SLE病情活動(dòng)指數(shù)(SLEDAI)[4]。同期選擇性別、年齡匹配的健康體檢者27人，其中男3例，女24例，年齡16～60歲，平均32.7歲。

本研究方案經(jīng)四川大學(xué)華西醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器： TPO和抗TPO抗體酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunoadsorption,ELISA)試劑盒(Cusabio Biotech Co.)、重組人TPO注射液(沈陽三生制藥有限責(zé)任公司)、靜脈注射用人免疫球蛋白(武漢生物制品研究所)；Dynabeads Protein G(Life Technologies AS，Morway)、噻唑藍(lán)(美國Sigma公司)；巨核細(xì)胞株MEG-01(上海北諾生物科技有限公司)。酶標(biāo)儀(Bio-Rad，Benchmark，Japan)。

1.2.2 血清TPO及抗TPO抗體水平測定：采用ELISA檢測受試者血清TPO水平及抗TPO抗體滴度，檢測按試劑盒說明書進(jìn)行。取250 μl重組人TPO標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行倍比稀釋，取100 μl標(biāo)準(zhǔn)液或待測血清加入預(yù)包被抗TPO抗體及重組人TPO的96孔板，每例均加復(fù)孔。37 ℃溫育2 h，棄孔中液體；PBS-T洗滌3次，加入100 μl酶結(jié)合工作液，37 ℃溫育1 h；以PBS-T洗板3次，加入100 μl 辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素，37 ℃溫育1 h；用PBS-T洗板6次，加入90 μl TMB底物溶液，37 ℃避光顯色20 min，每孔加入50 μl終止液；用酶標(biāo)儀測定波長450 nm處吸光度(A值)?？瞻讓φ找訮BS代替待測血清。

1.2.3 磁珠蛋白G法分離血清IgG： 采用磁珠蛋白G方法分別從6例抗TPO抗體陽性SLE患者混合血清池和6例抗TPO抗體反應(yīng)陰性的SLE患者中分離血清IgG。血清IgG分離按照說明書步驟進(jìn)行操作，在每管200 μl磁珠蛋白G(含1.5 mg蛋白G)懸液中加入血清200 μl，緩慢搖動(dòng)并孵育10 min，棄上清，用200 μl PBS-T洗2次，加入20 μl洗脫液晃動(dòng)2 min，收集上清，用1 mol/L Tris(pH7.5)調(diào)整pH值，用考馬斯亮法測定蛋白濃度，然后置于-70 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 MTT法檢測細(xì)胞增生活性：將巨核細(xì)胞株MEG-01按2×104/孔的密度接種于96孔板，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2孵箱中用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，加入不含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液100 μl，同時(shí)加入分離的抗TPO抗體陽性或陰性IgG，使終濃度分別達(dá)到5、10、20和40 μg/ml，以同樣方法加入靜脈注射用人免疫球蛋白作為正常對照，細(xì)胞培養(yǎng)1 h，再加入重組人TPO至終濃度40 μg/ml，于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)68 h，每孔加入20 μl質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5% MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀于490 nm波長處測定吸光度(A值)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組受檢者血清TPO水平比較

正常對照組、SLE血小板正常組和SLE伴血小板減少組受檢者血清TPO水平分別為(63.7±20.6)、(98.5±28.7)和(80.0±24.8)pg/ml，3組間總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.213，P=0.000)；其中SLE血小板正常組患者血清TPO水平明顯高于SLE伴血小板減少組和正常對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003、0.002)；SLE伴血小板減少組患者血清TPO水平略高于正常對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.169)(圖1A)。

2.2 各組受檢者血清抗TPO抗體滴度比較

正常對照組、SLE血小板正常組和SLE伴血小板減少組受檢者血清抗TPO抗體滴度(A值)分別為0.476±0.165、0.679±0.300和0.763±0.348，3組間總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.952，P=0.000)；SLE血小板正常組和SLE伴血小板減少組患者血清抗TPO抗體滴度均顯著高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000、0.007)；SLE血小板正常組與SLE伴血小板減少組間患者血清抗TPO抗體滴度的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.257)(圖1B)。將正常對照組受檢者血清抗TPO抗體滴度平均值+3SD(即A值>0.977)作為正常上限，大于正常上限值定義為陽性。SLE伴血小板減少組和SLE血小板正常組受檢者血清抗TPO抗體陽性率分別為32.0%(16/50)和25.6%(11/43)，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.462，P=0.497)，正常對照組未發(fā)現(xiàn)血清抗TPO抗體陽性者。進(jìn)一步對照抗TPO抗體陽性和陰性患者的糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑如環(huán)磷酰胺、硫唑嘌呤、霉酚酸酯等在檢測時(shí)的應(yīng)用情況，組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.562、0.213)。

圖 1 ELISA法測定受檢者血清TPO及其抗體水平Fig 1 Measurement of serum TPO and anti-TPO antibody by ELISA

2.3 患者血清TPO及抗TPO抗體水平與血小板計(jì)數(shù)的關(guān)系

SLE伴血小板減少組患者血小板計(jì)數(shù)與血清抗TPO抗體滴度呈顯著性負(fù)相關(guān)(r=-0.268，P=0.048)(圖2)，與血清TPO水平無明顯相關(guān)性(r=0.133，P=0.393)。SLE伴血小板減少組患者中，16例抗TPO抗體陽性患者平均血小板計(jì)數(shù)為(50.7±25.9)×109/L，明顯低于抗TPO抗體陰性患者的(68.2±19.1)×109/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012)。SLE血小板正常組患者血清TPO水平和抗TPO抗體滴度均與血小板計(jì)數(shù)無明顯相關(guān)性(r=0.028、-0.178，均P>0.05)。SLE伴血小板減少組16例抗TPO抗體陽性患者血清TPO水平為(68.2±22.0)pg/ml，明顯低于SLE血小板正常組抗TPO抗體陽性患者的(100.2±30.6)pg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)。

2.4 抗TPO抗體對巨核細(xì)胞增生活性的抑制作用

抗TPO抗體質(zhì)量濃度達(dá)到10 μg/ml時(shí)巨核細(xì)胞增生活性開始下降，隨著抗TPO抗體劑量的增大巨核細(xì)胞增生活性下降逐漸明顯?？筎PO抗體陰性SLE患者的IgG質(zhì)量濃度≥20 μg/ml時(shí)巨核細(xì)胞的增生活性下降(圖3)。巨核細(xì)胞在用正常人IgG刺激后呈增生增強(qiáng)現(xiàn)象，可能與注射人免疫球蛋白中含有清蛋白有關(guān)。

3 討論

血小板減少是SLE的常見表現(xiàn)之一，發(fā)生率為30%～58%，其中約16%是SLE的首發(fā)癥狀[1,5]。SLE并發(fā)血小板減少嚴(yán)重程度不一，輕度(血小板50～99×109/L)、中度(血小板21～50×109/L)和重度(血小板<20×109/L)分別占20%、25%和55%[6]。血小板持續(xù)性減少可導(dǎo)致SLE患者10年生存率下降30%左右，因此血小板減少是SLE患者早期死亡的唯一獨(dú)立因素[7]。目前認(rèn)為SLE患者體內(nèi)產(chǎn)生的多種抗血小板成分抗體加快血小板破壞及抗磷脂抗體導(dǎo)致的血小板消耗增多是SLE伴血小板減少的主要原因。但是本研究團(tuán)隊(duì)及其他作者在臨床研究中均發(fā)現(xiàn)，SLE伴血小板減少患者的骨髓巨核細(xì)胞數(shù)量及血小板的產(chǎn)生功能均較無血小板減少患者為低[2]，提示SLE伴發(fā)的血小板減少可能還與骨髓巨核細(xì)胞功能障礙致血小板的產(chǎn)生減少有關(guān)。

圖 2 SLE伴血小板減少組患者血清抗TPO抗體滴度與血小板計(jì)數(shù)相關(guān)性分析Fig 2 Correlation of serum anti-TPO antibody with platelet count in SLE with thrombocytopenia patients

圖 3 抗TPO抗體對巨核細(xì)胞增生活性的抑制作用Fig 3 Inhibition of TPO antibody on proliferative activity of meg-akaryocytes

TPO在調(diào)節(jié)巨核細(xì)胞功能方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用，即通過促進(jìn)巨核細(xì)胞增生及抑制凋亡而增加巨核細(xì)胞數(shù)量，通過增加巨核細(xì)胞體積和多倍核數(shù)量而促進(jìn)血小板的生成和釋放。為探討伴血小板減少SLE患者骨髓巨核細(xì)胞功能障礙是否與TPO水平改變有關(guān)，本研究進(jìn)行了TPO水平的檢查，結(jié)果顯示SLE伴血小板減少患者的血清TPO水平明顯低于無血小板減少的SLE患者，僅略高于正常人血清TPO水平，而且血清TPO水平與血小板計(jì)數(shù)無明顯的線性關(guān)系，這與其他研究結(jié)果[8-9]基本一致。

鑒于上述結(jié)果，SLE伴血小板減少患者血清TPO水平較正常人并未下降，故推測患者體內(nèi)可能存在抗TPO的自身抗體而導(dǎo)致TPO不能發(fā)揮正常生物學(xué)功能，為此本研究對患者血清抗TPO抗體進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，SLE伴血小板減少患者和不伴有血小板減少的患者血清TPO抗體滴度均顯著高于正常對照組，SLE伴血小板減少患者血清抗TPO抗體陽性率為32.0%，SLE血小板正常患者為25.6%，二者比較差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，正常人中無1例。這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的SLE患者產(chǎn)生抗TPO抗體發(fā)生率20%～43%[9]基本相符。吳曉丹等[10]的研究顯示，與抗TPO抗體陰性患者比較，抗TPO抗體陽性SLE患者更易發(fā)生血小板減少，而本研究未能發(fā)現(xiàn)SLE伴血小板減少患者與SLE血小板正?；颊唛g血清抗TPO抗體陽性率有明顯差異，但在SLE伴血小板減少患者中發(fā)現(xiàn)，抗TPO抗體滴度與血小板計(jì)數(shù)呈線性負(fù)相關(guān)，與抗TPO抗體陰性患者比較，抗TPO抗體陽性患者的血小板計(jì)數(shù)明顯降低。Ziakas等[9]也發(fā)現(xiàn)，抗TPO抗體的出現(xiàn)可使SLE患者的血小板平均下降67×109/L，但本研究未能在SLE血小板正常組發(fā)現(xiàn)抗TPO抗體與血小板計(jì)數(shù)間的線性關(guān)系，進(jìn)一步分析抗TPO抗體陽性的SLE伴血小板減少患者與抗TPO抗體陽性的SLE血小板正?；颊唛g血清TPO水平，發(fā)現(xiàn)前者TPO水平明顯低于后者，提示抗TPO抗體僅在TPO水平較低的情況下發(fā)揮病理作用，而不能拮抗高濃度TPO的生物學(xué)作用。

為進(jìn)一步明確抗TPO抗體在血小板減少中的作用，本研究在體外細(xì)胞培養(yǎng)過程中觀察其對巨核細(xì)胞增生的影響。結(jié)果顯示，抗TPO抗體可顯著抑制TPO誘導(dǎo)的巨核細(xì)胞增殖，并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。Ziakas等[11]也證實(shí)抗TPO抗體可抑制巨核細(xì)胞克隆形成。但本研究觀察到，從抗TPO抗體陰性SLE患者分離的IgG對巨核細(xì)胞具有一定的作用，表明SLE患者體內(nèi)還存在其他拮抗巨核細(xì)胞功能的抗體。筆者先前的研究中采用間接免疫熒光法證實(shí)，SLE患者體內(nèi)存在抗巨核細(xì)胞抗體[12]，Kuwana等[13]發(fā)現(xiàn)SLE患者還存在抗TPO受體抗體。這些結(jié)果表明，SLE伴血小板減少患者的巨核細(xì)胞功能障礙可能與多種自身抗體有關(guān)。

SLE的病理基礎(chǔ)為自身抗體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，在這一炎癥反應(yīng)過程中可產(chǎn)生大量趨化因子，包括巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、CXC配體13(CXC ligand 13，CXCL13)等。其中MIP-1α對骨髓巨核細(xì)胞具有明顯的抑制作用[14-15]，而SLE患者血清TPO水平明顯增高則是機(jī)體應(yīng)對MIP-1α造成巨核細(xì)胞損傷的保護(hù)性反應(yīng)[7]。本研究在SLE伴血小板減少的患者中觀察到，這類患者血清TPO水平明顯低于SLE血小板正常者，說明SLE伴血小板減少患者對MIP-1α損傷所產(chǎn)生的TPO水平雖然略高于正常水平，但不足以抵抗MIP-1a抑制巨核細(xì)胞的作用，而此時(shí)體內(nèi)若出現(xiàn)抗TPO抗體，則進(jìn)一步減弱了TPO拮抗MIP-1α的作用，這也足以解釋本研究觀察到的抗TPO抗體陽性患者較TPO抗體陰性患者具有更嚴(yán)重的血小板減少。同時(shí)，由于血小板正常的SLE患者體內(nèi)產(chǎn)生大量的TPO，即使抗TPO抗體陽性，也不足以阻斷TPO的生物學(xué)作用，因而對巨核細(xì)胞功能并無影響。

綜上所述，SLE患者對炎癥反應(yīng)的保護(hù)性TPO表達(dá)相對不足以及抗TPO抗體的產(chǎn)生等進(jìn)一步拮抗了TPO的生物學(xué)作用，可能在SLE伴發(fā)血小板減少的過程中發(fā)揮重要作用，血清TPO和抗TPO抗體的檢測可為臨床上應(yīng)用TPO對SLE伴發(fā)血小板減少者的治療提供可靠依據(jù)。