張睿，樊馬娟，方麗英，高作濱，劉楓

哈爾濱市兒童醫(yī)院口腔科，黑龍江哈爾濱 150010

由于乳牙的根管系統(tǒng)復雜且變異程度較大，以及對于兒童牙科操作和隔濕的困難，進而給兒童牙科醫(yī)生進行乳牙根管治療帶來挑戰(zhàn)。乳牙的根尖孔粗大，側枝根管較多，牙本質小管容易暴露，加上乳牙生理性根吸收可能引起的結構變化，進而增加微生物毒素滲透到牙根表面的可能性[1]。因此，從感染牙齒根管系統(tǒng)中消除生物膜是一個對于臨床治療來說是一個挑戰(zhàn)。具有抗菌活性的根管充填材料在促進菌群清除方面起著重要作用。以下幾種材料已被用作乳牙根管充填材料。在乳牙中，氧化鋅丁香油酚已被廣泛使用[2]。由于氧化鋅有刺激性強且不易被吸收的缺點，在其中加入抗菌活性和生物相容性較好且易吸收的碘仿或氫氧化鈣的產(chǎn)品也已經(jīng)進入臨床使用[3]。Vitapex主要成分是氫氧化鈣和碘仿和聚硅氧烷油組成，具有卓越的抗菌活性和X射線阻射性，使用方便不需要預先調制糊劑，隨取隨用，而且不易污染。采用注射方式易于將糊劑充填至根管中，注射性可加壓充填方式解決了細彎幾側枝根管的充填難題，操作易于掌握，省時簡便，一次性針尖可預防交叉感染[8]。Vitapex在氫氧化鈣糊劑中加入碘仿不僅增強防腐功能，而且兩者的生物相容性都很好。該糊劑中還有一定量的硅油，可使充填材料具有良好的流動性和滲透性，有利于進入乳牙豐富的側副根管中。而氧化鋅糊劑雖有良好的安撫鎮(zhèn)痛作用，但由于其作用時間短，對遠期炎癥控制差，且氧化鋅可以被根尖滲出物浸潤吸收，給炎癥的復發(fā)創(chuàng)造了一定的機會，此外，氧化鋅糊劑對根管壁的黏接性太強，減少了糊劑的流動性，較難進入側副根管，遺留滲出積儲的溫床，進一步增加了炎癥。

近年來，活性染色和共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）已成為一種廣泛使用的不同材料對單種和多種細菌生物膜的抗菌效應的測量方法。生物膜是一個嵌入在胞外聚合物基體和附著在固體表面的微生物群落，細菌生長在生物膜中產(chǎn)生持續(xù)性感染。微生物侵入根管系統(tǒng)，最終導致牙髓壞死、根尖周炎。在壞死根管內細菌生長主要是游離的形式，根管治療的成功將取決于這種生物膜是否有效的消除[4]。該研究用活菌染色法和共聚焦激光掃描顯微鏡染色檢測常用乳牙根管材料的抗生物膜的能力。

1 材料與方法

1.1 實驗分組

實驗分為4組：對照組（去離子水）、氧化鋅碘仿組、Vitapex組、氫氧化鈣組。

1.2 生物膜的培養(yǎng)

三十六羥磷灰石（HA）培養(yǎng)皿（0.38-inch直徑0.06-inch厚度，美國）作為生物膜的培養(yǎng)基。HA培養(yǎng)基加入Ⅰ型牛膠原白（10 mg/mL膠原蛋白）在4℃過夜。從健康成人志愿者中收集齦下菌斑，并在腦心浸液培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在分光光度計405 nm處調整細胞密度，密度約為7.5～107每毫升菌落形成單位。在厭氧條件下培養(yǎng)在24孔細胞培養(yǎng)皿，用厭氧袋和厭氧指示劑在37℃條件下使菌斑懸浮。每個孔含有1.8 mL無菌腦心浸液培養(yǎng)基和0.2 mL接種物，樣品保存在水中。每周更換1次新鮮的培養(yǎng)基。

1.3 生物膜細菌存活率測定

在培養(yǎng)3周生物膜上，小心地放置一層薄薄的根管充填材料（0.1 g）。然后將標本放入培養(yǎng)箱中，試驗期為7 d和30 d（n=3）。用細菌存活試劑盒定量分析。按照制造商的指示在溶液中染色膜。使用激光共聚焦顯微鏡觀察。同時采用雙通道成像顯示綠色和紅色熒光。綠色熒光染色的為活菌，而受損的細菌膜染色產(chǎn)生紅色熒光。用Imaris 7.2軟件分析活/死的比率。紅色熒光到綠色熒光和紅色熒光的體積比表明死亡細胞的比例。采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行方差分析和Tukey分析死細胞體積的比例。

2 結果

共分析了180個掃描的生物膜區(qū)域，分別為紅色和綠色熒光的比例。不同根管材料的微生物殺滅效果差異有統(tǒng)計學意義（F＝73.073，P＜0.05）。 致死微生物的比例也取決于暴露時間。在陰性對照組，經(jīng)過7 d的細菌細胞93%是活菌，30 d后為94%，Vitapex都對生物膜最有效的材料，見表1、圖1。

表1 不同根管充填材料對生物膜中死菌體積的比例（±s）

表1 不同根管充填材料對生物膜中死菌體積的比例（±s）

組別7 d 3 0 d對照組氧化鋅碘仿組V i t a p e x組氫氧化鈣組0.0 8±0.0 6 0.3 5±0.6 4 0.4 8±0.4 3 0.1 6±0.7 8 0.0 6±0.0 4 0.3 4±0.0 8 0.5 1±0.1 4 0.1 9±0.1 0

圖1 不同根管充填材料對生物膜中死菌的激光共聚焦結果

3 討論

乳牙根管充填材料用于的抗菌作用已在瓊脂擴散實驗或直接接觸試驗有很多的研究，但這些研究都有很大的局限性，不適合于研究生物膜的微生物殺滅[5-6]。因此，很少有關于這些材料對根管生物膜的研究。到目前為止，只有少數(shù)使用激光共聚焦顯微鏡和雙組分的染色法評價根管充填材料對乳牙進行抗菌作用的研究。這種方法目前常用于評價不同材料對根管感染微生物的抗菌效果，并提出了一種快速和相對容易使用的方法[7]。試劑盒中的兩種物質在進入正常和損傷細菌細胞的能力是不同的；活的細菌細胞膜完整的綠色熒光，而損傷的細胞膜則為熒光紅。認為生物膜的各種不同的細菌存在于根管系統(tǒng)的不可到達區(qū)域，并且在這些區(qū)域中微生物一般代謝率較低，并且往往對抗菌劑有較強抵抗力[8]。因此，根管充填材料應利用多物種生物膜模型測試其抗菌能力。

該研究結果表明，不同根管材料在殺滅生物被膜的效果上存在顯著差異。氫氧化鈣對生物膜表現(xiàn)出微弱的影響。氫氧化鈣對游離培養(yǎng)中生長的根管細菌有較強潛力。然而，對生物膜的影響是不確定的。此外，沖洗根管的藥物一般為次氯酸鈉溶液，這樣的結果較難維持高濃度的氫氧根離子[9]。

氧化鋅碘仿在很短的時間有抗菌作用。盡管有一些研究表明含有氧化鋅的物質具有很強的抗菌作用，但其他研究顯示只有有限的抗菌活性，這種差異可以用瓊脂擴散法中的混雜因素、不同種類的細菌測試和丁香酚的濃度來解釋[10]。該研究結果表明，氧化鋅對生物膜微生物表現(xiàn)出中等程度的活性。一旦設定了氧化鋅，它就沒有特別的抗菌作用，這可以解釋7 d后暴露的生物膜細菌為什么沒有被殺死。

Vitapex在乳牙根管治療療效臨床和影像學成功可能與在與活體組織接觸時，其抗菌性能和快速吸收材料的獨特性能有關。我們的研究結果表明，與其他研究一致[11]，認為Vitapex的良好的性能是由于碘仿，因為碘仿單獨也導致近70%的生物膜的細菌殺死。

根管充填材料的抗菌效果對于牙髓治療的成功是至關重要的，它不是理想材料所需要的唯一特性，應該進行更多的研究來評估乳牙牙髓治療材料的其他生物學特性。