王潔 ，吳琦 ，王宏蘭 ，孫曉杰 ，衣同輝 ，郭紅艷 ，齊曉丹 ，劉哲丞

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院物理教研室，黑龍江齊齊哈爾 161000；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院臨床生物化學(xué)教研室，黑龍江齊齊哈爾 161000；3.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾 161000；4.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，黑龍江齊齊哈爾 161000

傳統(tǒng)抗生素的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用為治療感染性疾病提供了非常有效的途徑，但是細(xì)菌對(duì)傳統(tǒng)抗生素耐藥性日益嚴(yán)重，這導(dǎo)致了人們對(duì)尋找新型作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制的抗菌藥物研究?？咕木哂胁煌趥鹘y(tǒng)抗生素的作用機(jī)制，不易產(chǎn)生耐藥性，是抗生素的理想替代藥物[1]。Cn-AMP類(lèi)抗菌肽來(lái)源于拉丁美洲的綠椰子汁液[2]。抗菌肽Cn-AMP2是一條11個(gè)氨基酸組成的酸性多肽（氨基酸序列：TESYFVFSVGM）。該文通過(guò)Fmoc固相合成法合成了抗菌肽Cn-AMP2并測(cè)定其在不同溶液體系中的二級(jí)結(jié)構(gòu)；然后測(cè)定了抗菌肽Cn-AMP2的抗菌活性。使用不同光譜探針測(cè)定了其對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜和基因組DNA的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

9-芴甲氧羰基(Fmoc)-氨基酸、Rink amide MBHA樹(shù)脂及2,2,2-三氟乙醇(TFE)購(gòu)自吉爾生化(上海)有限公司;MH肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限公司。溴化乙錠和PBS溶液購(gòu)置北京鼎國(guó)昌盛有限公司。

大腸埃希菌ML-35購(gòu)自美國(guó)ATCC菌種保藏中心，大腸埃希菌ATCC25922，銅綠假單胞菌ATCC227 853，銅綠假單胞菌ATCC9027，肺炎克雷伯菌ATCC 700603，金黃色葡萄球菌ATCC25923，表皮葡萄球菌ATCC12228，藤黃微球菌ATCC4698，糞腸球菌ATCC 21912和枯草芽孢桿菌 ATCC6633購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

2545制備型高效液相色譜（Waters公司，美國(guó)）;J-815型圓二色光譜儀(JASCO公司，日本)；UV-2550紫外分光光度計(jì)（島津公司，日本）；RF-5301 PC型熒光分光光度計(jì)（島津公司，日本）。

1.2 抗菌肽Cn-AMP2的合成與純化

采用Fmoc固相多肽合成法合成多肽序列，使用Rink amide MBHA樹(shù)脂為載體，9-芴甲氧羰基(Fmoc)-氨基酸為原料進(jìn)行合成。合成結(jié)束后，粗肽用三氟乙酸（TFA）從樹(shù)脂上切下來(lái)，利用2545制備型高效液相色譜進(jìn)行制備。采用含0.1%TFA的雙蒸水（A相）和含0.1%TFA的乙腈（B相）為流動(dòng)相，用1 mL/min流速采用ACQUITY UPLC BEH300色譜柱進(jìn)行梯度洗脫，收集純品進(jìn)行真空冷凍干燥得到多肽樣品并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

1.3 抗菌肽Cn-AMP2最低抑菌濃度MIC測(cè)定

將保存的菌株涂布LB固體培養(yǎng)基平板，于37℃培養(yǎng)24 h。挑取單克隆菌落接種MH液體培養(yǎng)基，37℃，180 rpm過(guò)夜振蕩培養(yǎng)。用MH培養(yǎng)基將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液稀釋到 5×105CFU/mL，按 90 μL/孔加入到 96 孔細(xì)菌培養(yǎng)板中；將抗菌肽Cn-AMP2從1 mg/mL開(kāi)始倍比稀釋后，按10 μL/孔加入到菌液中；然后于 37℃，180 rpm，培養(yǎng) 24 h；測(cè)定 OD590nm，計(jì)算最低抑菌濃度MIC。重復(fù)操作3次，計(jì)算MIC平均值[3]。

1.4 抗菌肽Cn-AMP2二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定

在25℃條件下，使用圓二色光譜儀測(cè)定抗菌肽Cn-AMP2的二級(jí)結(jié)構(gòu)。分別在KP緩沖液(pH 7.0，50 mmol/L KH2PO4/K2HPO4,100 mmol/L KCl)及含有50%TFE的KP緩沖液中測(cè)定75 μmol/L多肽。測(cè)定波長(zhǎng)范圍OD190nm-OD250nm。使用摩爾橢圓率公式 [θ]=θ/10lCMn計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.5 抗菌肽Cn-AMP2對(duì)細(xì)菌外膜滲透性實(shí)驗(yàn)

如果細(xì)菌外膜遭到破壞，N-苯基-1-萘胺 （N-phenyl-1-naphthylamine,NPN）會(huì)發(fā)出強(qiáng)烈熒光。選取大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌，用含有5 mM NPN的pH 7.4，5 mM HEPES緩沖液調(diào)整對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌濃度調(diào)整為8×108CFU/mL后，加入終濃度為5 μg/mL，2.5 μg/mL和1.25 μg/mL的多肽進(jìn)行測(cè)定。用生理鹽水作為對(duì)照組。熒光測(cè)定的激發(fā)波長(zhǎng)為350 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為420 nm。

1.6 抗菌肽Cn-AMP2與EB競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合基因組DNA的熒光光譜

按照文獻(xiàn)報(bào)道方法提取大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的基因組DNA。取濃度為500 μg/mL的大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA溶液（含1.5 μg/mL EB）50 μL 加入加入等體積的抗菌肽 Cn-AMP2，37℃避光孵育10 min。用OD535nm波長(zhǎng)激發(fā)，測(cè)量反應(yīng)體系在OD550nm-OD750nm波長(zhǎng)范圍的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 抗菌肽Cn-AMP2的合成及純化結(jié)果

使用Fmoc固相合成方式合成抗菌肽Cn-AMP2后，將冷凍干燥獲得的粗肽用15%的乙腈溶解后，使用Waters 2545型高效液相色譜進(jìn)行制備，收集多肽純品并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定（圖1）?？咕腃n-AMP2理論分子量為1 266.42 Da，質(zhì)譜鑒定為1 266.40 Da（圖2）。質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明多肽序列合成正確。

圖1 抗菌肽Cn-AMP2純化結(jié)果

圖2 抗菌肽Cn-AMP2質(zhì)譜鑒定結(jié)果

2.2 抗菌肽Cn-AMP2最低抑菌濃度MIC測(cè)定結(jié)果

采用微量肉湯稀釋法測(cè)定抗菌肽Cn-AMP2的最低抑菌濃度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抗菌肽Cn-AMP2對(duì)革蘭陰性菌和革蘭陽(yáng)性菌都具有良好的殺傷效果，最低抑菌濃度在 50.0～100.0 μg/mL（表 1）。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明抗菌肽Cn-AMP2是一條具有廣譜抗菌活性的多肽。

表1 抗菌肽Cn-AMP2最低抑菌濃度MIC測(cè)定結(jié)果

2.3 抗菌肽Cn-AMP2二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定結(jié)果

使用了KP緩沖液模擬生理環(huán)境，使用KP緩沖液/TFE混合溶液模擬細(xì)菌細(xì)胞膜疏水環(huán)境。在KP緩沖液中，抗菌肽Cn-AMP2在OD222nm波長(zhǎng)處橢圓率為590 degree·cm2·dmol-1， 表明抗菌肽 Cn-AMP2 的結(jié)構(gòu)為無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。但在KP緩沖液/TFE混合溶液，抗菌肽Cn-AMP2在OD222nm波長(zhǎng)處橢圓率為-2 548 degree·cm2·dmol-1，表明抗菌肽 Cn-AMP2 的結(jié)構(gòu)為螺旋結(jié)構(gòu)（圖3）。

圖3 抗菌肽Cn-AMP2在不同溶液體系中的二級(jí)結(jié)構(gòu)

2.4 抗菌肽Cn-AMP2對(duì)細(xì)菌外膜滲透性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

細(xì)菌外膜滲透性實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)不同濃度的抗菌肽Cn-AMP2與大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌作用后，熒光染料NPN產(chǎn)生了強(qiáng)烈熒光（圖4、圖5）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果熒光染料NPN在2～3 min左右插入到細(xì)菌細(xì)胞外膜的疏水性核心區(qū)。說(shuō)明細(xì)胞膜是抗菌肽Cn-AMP2的作用靶點(diǎn)之一。

圖4 抗菌肽Cn-AMP2與大腸埃希菌細(xì)胞膜作用結(jié)果

圖5 抗菌肽Cn-AMP2與金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜作用結(jié)果

2.5 抗菌肽Cn-AMP2與EB競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合基因組DNA的熒光光譜

抗菌肽Cn-AMP2加入到基因組DNA和溴化乙錠EB的混合體系后，EB-DNA復(fù)合體系的熒光強(qiáng)度發(fā)生明顯的衰減，并且隨著抗菌肽Cn-AMP2濃度增加熒光強(qiáng)度不斷降低；說(shuō)明抗菌肽Cn-AMP2與EE竟?fàn)幮越Y(jié)合大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA，基因組DNA是抗菌肽Cn-AMP2的作用靶點(diǎn)之一[4]（圖 6、圖 7）。

圖6 抗菌肽Cn-AMP2與大腸埃希菌基因組DNA作用結(jié)果

圖7 抗菌肽Cn-AMP2與金黃色葡萄球菌基因組DNA作用結(jié)果

3 討論

隨著細(xì)菌耐藥性問(wèn)題的日益嚴(yán)重，抗菌肽的研究受到了廣泛重視?？咕臍≡臋C(jī)理研究中，研究者多關(guān)注抗菌肽與細(xì)菌細(xì)胞膜的相互作用，并提出了“桶板模型”“地毯模型”“蟲(chóng)孔模型”和“膜區(qū)分模型”等來(lái)解釋抗菌肽。隨著研究的深入，基因組DNA,DnaK酶等胞內(nèi)靶點(diǎn)也受到研究者的重視?？咕腜R-39和Lfcin等通過(guò)與胞內(nèi)靶點(diǎn)結(jié)合，從而對(duì)細(xì)菌的基因表達(dá)及RNA轉(zhuǎn)錄等產(chǎn)生抑制作用，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡[5]。抗菌肽AN5-1和抗菌肽AN5-2則是對(duì)細(xì)胞膜和基因組DNA都產(chǎn)生作用，從而提高了抗菌活性[6]。

該次通過(guò)Fmoc固相合成的方式制備了抗菌肽Cn-AMP2，為了檢測(cè)抗菌肽Cn-AMP2的抗菌活性，選取了8種臨床常見(jiàn)的病原菌株。MIC測(cè)定結(jié)果表明抗菌肽Cn-AMP2對(duì)多種革蘭陰性菌和革蘭陽(yáng)性菌具有殺傷作用，最低抑菌濃度為50.0～100.0 μg/mL。針對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌比較，抗菌肽Cn-AMP2的抗菌活性無(wú)明顯區(qū)別。以往文獻(xiàn)報(bào)道中，抗菌肽Cn-AMP2對(duì)白色念珠菌等的抑菌濃度為80 μg/mL左右，說(shuō)明抗菌肽Cn-AMP2具有廣譜抗菌活性[7]。圓二色光譜測(cè)定表明抗菌肽Cn-AMP2在222nm波長(zhǎng)處有特征吸收，說(shuō)明其結(jié)構(gòu)是α螺旋結(jié)構(gòu)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的2 800多種抗菌肽中，α螺旋結(jié)構(gòu)抗菌肽所占比例最高，說(shuō)明抗菌肽Cn-AMP2的結(jié)構(gòu)屬于抗菌肽中最常見(jiàn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。α螺旋結(jié)構(gòu)抗菌肽的作用靶點(diǎn)多為細(xì)菌細(xì)胞膜，膜滲透性實(shí)驗(yàn)結(jié)果確認(rèn)了細(xì)菌的細(xì)胞膜是Cn-AMP2的作用靶點(diǎn)之一。熒光光譜實(shí)驗(yàn)證明細(xì)菌基因組DNA是抗菌肽的另一個(gè)作用靶點(diǎn)，抗菌肽Cn-AMP2引發(fā)DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而影響細(xì)菌基因組DNA的轉(zhuǎn)錄翻譯，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。這說(shuō)明和抗菌肽AN5-1和NK-18相似，抗菌肽Cn-AMP2也是雙靶點(diǎn)作用抗菌肽，但對(duì)于抗菌肽Cn-AMP2對(duì)基因組轉(zhuǎn)錄翻譯的具體影響過(guò)程，尚需要進(jìn)一步研究。