周改， 周朦， 馮雯， 楊蕭天， 顧漱溟， 章美婷， 徐岷

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院 1. 消化內(nèi)科； 2. 呼吸內(nèi)科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

結(jié)直腸癌是近幾十年來發(fā)病率和死亡率在大多數(shù)國家和地區(qū)上升最快的腫瘤之一[1]。結(jié)直腸癌早期癥狀不明顯，一般會(huì)經(jīng)歷7～10年的從正常黏膜組織—腺瘤—早期癌—進(jìn)展期癌的演變過程。如果患者在疾病的早期階段或癌前腺瘤階段得到明確診斷，超過95%的結(jié)直腸癌患者可通過手術(shù)治愈[2]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的RNA分子。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA可作為診斷和預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物，可在組織、血清和尿液中檢出[3-4]。漿細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因1(plasmacytoma variant translocation gene 1，PVT1)是近幾年發(fā)現(xiàn)的定位于染色體8q24區(qū)的lncRNA，在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞中呈高表達(dá)[5]，但在結(jié)直腸癌患者外周血中的表達(dá)情況尚不清楚。為此，本研究旨在檢測(cè)PVT1在結(jié)直腸癌患者血漿中的表達(dá)并分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，并將結(jié)直腸癌患者術(shù)前及術(shù)后血漿中PVT1的表達(dá)水平進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取自2016年5月至2017年7月在江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院住院的結(jié)直腸腺瘤患者30例和結(jié)直腸癌患者90例。結(jié)直腸腺瘤患者中，男20例，女10例；年齡45～84歲，平均(62.40±10.83)歲。結(jié)直腸癌患者中男45例，女45例；年齡38～86歲，平均(66.98±10.65)歲。所有患者均經(jīng)組織病理學(xué)確診，且術(shù)前均未接受任何抗腫瘤治療。另選擇同期本院體檢中心的健康體檢者42例作為對(duì)照組，其中男23例，女19例；年齡37～85歲，平均(64.43±10.31)歲。

為明確及進(jìn)一步判斷血漿PVT1表達(dá)水平能否有效鑒別早期結(jié)直腸癌患者與健康對(duì)照者，將結(jié)直腸癌患者進(jìn)一步劃分為TNM Ⅰ/Ⅱ期(早期)及TNM Ⅲ/Ⅳ期(進(jìn)展期)2組。TNM分期按照國際抗癌聯(lián)盟(UICC)第七版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行：Ⅰ/Ⅱ期40例，Ⅲ/Ⅳ期50例。本研究經(jīng)江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有標(biāo)本采集前均征得受試者知情同意。

1.2 主要試劑和儀器

Trizol試劑(美國Life公司)；ChamQTM SYBR?qPCR Master Mix(Low ROX Premixed) 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(H-)Reverse Transcriptase(R021- 01)試劑盒購自諾唯贊生物科技有限公司；lncRNA PVT1與內(nèi)參基因5S RNA引物由上海生工生物工程有限公司合成。主要儀器包括NanoDrop 2000 紫外分光光度儀(美國Thermo公司)，7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.3 樣本收集

采集患者、健康體檢者以及接受外科病灶切除手術(shù)治療2～3周后配對(duì)的同一結(jié)直腸癌患者(29例)清晨空腹頭臂靜脈血約5 mL，置于EDTA-K2抗凝真空管中；3 h內(nèi)于4 ℃，16 000×g，離心10 min；取上清液于無RNA酶的1.5 mL EP管中；4 ℃ 1 600×g再次離心10 min徹底去除細(xì)胞成分；重新收集上層血漿至新的無RNA酶的EP管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

同時(shí)收集患者及健康體檢者的臨床及隨訪資料用于病理參數(shù)分析。

1.4 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

將血漿置于冰上解凍后，取400 μL按照試劑說明書使用Trizol試劑提取總RNA。用紫外分光光度儀測(cè)定提取RNA的濃度和純度。選取D(260 nm)/D(280 nm)在1.8～2.0的樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)程序：25 ℃ 10 min，42 ℃ 45 min，70 ℃ 15 min。cDNA樣本置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 熒光定量PCR(qPCR) 檢測(cè)血漿中 PVT1的表達(dá)

以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，采用qPCR檢測(cè)PVT1及內(nèi)參5S RNA的表達(dá)水平。PVT1引物序列：上游5′-AGCCAGTCTTGGTGCTCTGT-3′，下游5′-GCCTCAGTGAACTCCTCAGC-3′。內(nèi)參5S RNA引物序列：上游5′-GTCTACGGCCATACCACCCTGAA-3′，下游5′-AAGCCTACAGCACCCGGTATTCC-3′。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 1 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。最后得到擴(kuò)增曲線和熔解曲線，讀取各樣本中目的PVT1及內(nèi)參5S RNA的循環(huán)閾值(Ct值)，即擴(kuò)增產(chǎn)物量達(dá)到臨界閾值時(shí)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)。通過ΔCt方法計(jì)算各目的基因的相對(duì)表達(dá)值，作為評(píng)估目的lncRNA在疾病組和健康對(duì)照組中表達(dá)差異的指標(biāo)，ΔCt值越小表示該目的lncRNA的相對(duì)表達(dá)水平越高[6]，以對(duì)照組為參照，低ΔCt值表明其在血漿中表達(dá)上調(diào)；高則下調(diào)。此外，采用2-△△Ct方法計(jì)算結(jié)直腸癌患者術(shù)前和術(shù)后血漿中PVT1的相對(duì)表達(dá)水平[7]。ΔCt=CtPVT1-Ct5S RNA，△△Ct=△Ct疾病組-△Ct對(duì)照組，疾病組包括術(shù)前患者組和術(shù)后患者組。實(shí)驗(yàn)中以96孔板進(jìn)行樣本篩選，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取平均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖采用GraphPad Prism 5.0軟件繪制。數(shù)據(jù)分析采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，兩組間比較采用非參數(shù)Mann-WhineyU檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以中位數(shù)(四分位數(shù))[M(P25，P75)]表示。術(shù)前與術(shù)后血漿中PVT1表達(dá)水平的比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。利用受試者工作特征曲線(receiver operator characteristic curve，ROC)評(píng)價(jià)PVT1、癌胚抗原及二者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)直腸癌的診斷效能，同時(shí)計(jì)算其相應(yīng)的靈敏度、特異度。Youden指數(shù)(靈敏度+特異度-1)用于確定最佳截?cái)嘀?。P<0.05(雙側(cè))為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PVT1在結(jié)直腸腺瘤、結(jié)直腸癌患者血漿中的表達(dá)

如圖1所示，與健康對(duì)照組相比，PVT1在結(jié)直腸腺瘤組(Z=-3.324，P<0.01)及結(jié)直腸癌組(Z=-5.135，P<0.01)的表達(dá)明顯升高，且PVT1在結(jié)直腸癌組的表達(dá)明顯高于結(jié)直腸腺瘤組(Z=-2.188，P=0.029)。此外，PVT1在TNM Ⅰ/Ⅱ期結(jié)直腸癌患者血漿中的表達(dá)較健康對(duì)照組明顯升高(Z=-4.184，P<0.01)；但TNM Ⅰ/Ⅱ期和Ⅲ/Ⅳ期二組間PVT1的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

a：P<0.05, b： P<0.01；ΔCt值越小代表表達(dá)量越高

2.2 結(jié)直腸癌患者術(shù)前及術(shù)后血漿中PVT1的表達(dá)

如圖2所示，結(jié)直腸癌患者術(shù)后血漿PVT1的表達(dá)水平(1.35±0.87)較術(shù)前表達(dá)水平(3.64±3.15)明顯降低(t=4.258，P<0.01)。

2.3 結(jié)直腸癌患者血漿中PVT1表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

分析結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者血漿中PVT1相對(duì)表達(dá)量與患者年齡、性別及腫瘤部位、大小、分化程度，有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床特征無明顯相關(guān)性(P均>0.05)。見表1。

圖2 結(jié)直腸癌患者術(shù)前及術(shù)后血漿中PVT1表達(dá)水平的比較

表1 結(jié)直腸癌患者血漿中PVT1的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 M(P25, P75)，n=90

*：Kruskal-WallisH檢驗(yàn)

2.4 血漿PVT1對(duì)結(jié)直腸癌的診斷價(jià)值分析

ROC曲線分析顯示(圖3)，血漿PVT1診斷結(jié)直腸癌，特別是TNM Ⅰ/Ⅱ期結(jié)直腸癌的AUC值(0.781，0.768)均高于傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原(0.745，0.733)。盡管在最佳截?cái)帱c(diǎn)血漿PVT1診斷結(jié)直腸癌及TNM Ⅰ/Ⅱ期結(jié)直腸癌的特異性(71.4%，76.2%)均低于癌胚抗原(97.6%，90.5%)，但其對(duì)結(jié)直腸癌及TNM Ⅰ/Ⅱ期結(jié)直腸癌的診斷敏感性(78.6%，71.1%)較癌胚抗原均顯著升高。此外，血漿PVT1聯(lián)合癌胚抗原后診斷結(jié)直腸癌及TNM Ⅰ/Ⅱ期結(jié)直腸癌的AUC值分別為0.863和0.854，較單獨(dú)檢測(cè)PVT1或癌胚抗原均升高，且二者聯(lián)合后對(duì)結(jié)直腸癌的診斷特異性較單一指標(biāo)PVT1明顯升高，對(duì)TNM Ⅰ/Ⅱ期結(jié)直腸癌的診斷敏感性也明顯提高。見表2和表3。

圖3 血漿PVT1與腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原單獨(dú)及聯(lián)合后診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線比較

指標(biāo)AUC靈敏度(%)特異度(%)截?cái)嘀礟值95% CIPVT10.78178.671.40.500<0.010.693～0.869癌胚抗原0.74546.497.60.440<0.010.661～0.830PVT1+癌胚抗原0.86378.683.30.619<0.010.799～0.926

表3 血漿PVT1在TNM Ⅰ/Ⅱ期結(jié)直癌中的效能評(píng)價(jià)

3 討論

已證實(shí)lncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，包括結(jié)直腸癌[8-10]，大量研究表明，即使經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的室溫放置、反復(fù)凍融、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或RNA酶A的消化處理，在血清或血漿中仍可檢測(cè)到穩(wěn)定的循環(huán)lncRNA存在[4，11-12]。已證實(shí)lncRNA PVT1在惡性腫瘤如胃癌[13]、肝癌[14]、宮頸癌[15]、黑色素瘤[16]等患者的血清/血漿中呈差異性表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，PVT1在結(jié)直腸腺瘤及結(jié)直腸癌患者血漿中的表達(dá)均明顯升高，且在結(jié)直腸癌組的表達(dá)較癌前病變組升高明顯，這有利于臨床診斷中根據(jù)PVT1的相對(duì)表達(dá)水平判斷結(jié)直腸疾病的嚴(yán)重程度，有助于早期發(fā)現(xiàn)腺瘤性息肉患者，從而通過早期切除息肉將大大降低結(jié)直腸癌的發(fā)病率，改善結(jié)直腸疾病患者的預(yù)后。此外，PVT1在TNM Ⅰ/Ⅱ期及TNM Ⅲ/Ⅳ期結(jié)直腸癌患者血漿中表達(dá)均高于對(duì)照組，但TNM Ⅰ/Ⅱ期及TNM Ⅲ/Ⅳ期間表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這種循環(huán)lncRNA在癌前病變及癌變患者血漿中存在差異性表達(dá)，卻并不隨腫瘤惡性程度增高而表達(dá)量增高的現(xiàn)象，可能與lncRNA的分泌及其在癌前病變及癌癥患者外周血中存在的機(jī)制不同有關(guān)；此外，還可能與腫瘤患者間存在的異質(zhì)性有關(guān)，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

循環(huán)中的lncRNA可能主要來自腫瘤細(xì)胞或組織，待腫瘤切除后，外周血中特定lncRNA的水平將恢復(fù)至正常[17-18]。例如，胃癌患者術(shù)后15 d血漿中l(wèi)ncRNA-a174084的表達(dá)水平明顯低于術(shù)前[19]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者術(shù)后血漿中PVT1的表達(dá)水平較術(shù)前明顯降低，表明PVT1可作為結(jié)直腸癌患者術(shù)后療效監(jiān)測(cè)的指標(biāo)。外周血中異常表達(dá)的lncRNA與腫瘤患者的臨床病理參數(shù)有關(guān)[20]，而本研究中尚未發(fā)現(xiàn)血漿lncRNA表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性，這可能與疾病的異質(zhì)性、部分分組數(shù)量較少、組間偏倚較大等因素有關(guān)。

通過對(duì)ROC曲線及對(duì)AUC分析發(fā)現(xiàn)，血漿PVT1表達(dá)水平對(duì)結(jié)直腸癌，特別是相對(duì)早期的TNM Ⅰ/Ⅱ期結(jié)直腸癌均有較好的診斷價(jià)值。相比于傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原，PVT1診斷結(jié)直腸癌，特別是早期結(jié)直腸癌的敏感性更高，因此可用于結(jié)直腸癌高危人群的大規(guī)模篩查。鑒于腫瘤和人類均具有異質(zhì)性，往往很難確定一個(gè)性能優(yōu)異的單一理想生物標(biāo)志物。癌胚抗原最初提取自結(jié)腸腺癌組織，但其不僅在胃腸道惡性腫瘤中呈高表達(dá)，在乳腺癌、肺癌等其他惡性腫瘤以及吸煙、妊娠、糖尿病、肝硬化等情況中也呈高表達(dá)[21]。研究表明，循環(huán)miRNAs與傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物結(jié)合后可提高對(duì)癌癥疾病的診斷能力[22]。僅僅采用一種循環(huán)lncRNA作為疾病診斷標(biāo)志物往往缺乏特異性。研究證實(shí)，循環(huán)lncRNA與常規(guī)腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原、CA72-4等的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)患者的診斷和預(yù)后有更好的提示作用[23]。本研究結(jié)果顯示，血漿PVT1聯(lián)合腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原后對(duì)結(jié)直腸癌以及其中的TNM Ⅰ/Ⅱ期結(jié)直腸癌的診斷效能均較單獨(dú)檢測(cè)PVT1或癌胚抗原升高。特別是二者聯(lián)合檢測(cè)后對(duì)TNM Ⅰ/Ⅱ期結(jié)直腸癌的診斷靈敏度提高，這將有利于在早期篩查出更多的腫瘤患者，從而改善預(yù)后。

由此得出，在結(jié)直腸癌患者血漿中異常高表達(dá)的lncRNA PVT1可作為結(jié)直腸癌早期診斷及術(shù)后療效監(jiān)測(cè)的潛在循環(huán)分子標(biāo)志物。此外，血漿PVT1與傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原聯(lián)合檢測(cè)將更加有利于結(jié)直腸癌高危人群的早期篩查，從而降低結(jié)直腸癌發(fā)病率，改善患者生活質(zhì)量。