孔 琦，黃 強，陳 斌，王道明，朱家勝，夏亞斌

(1.皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院胃腸外科，安徽 蕪湖 241001;2.安徽省立醫(yī)院普外科，安徽 合肥 230001)

正常機體免疫功能需Th1、Th2細胞因子維持一定的動態(tài)平衡，當平衡失調(diào)造成Th1或Th2轉(zhuǎn)化時，稱之為Th1/Th2偏移[1]，而Th1/Th2偏移與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2-3]，進一步研究Th1/Th2偏移如何影響惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展成為目前研究重點，我們用白介素-2(interleukin-2，IL-2)、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)作為Th1細胞因子代表，Th2細胞因子用IL-4、IL-6代表，觀察尼美舒利對人膽管癌細胞Th1/Th2偏移的逆轉(zhuǎn)作用，進一步探討其對膽管癌細胞生長的影響，為選擇性環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)抑制劑抗腫瘤作用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑人肝內(nèi)膽管癌細胞系HCCC-9810購白中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞庫；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent adsorption ，ELISA)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記的抗IFN-γ和熒光素(phycoerythrin，PE)標記的抗IL-4單抗均購自美國Biolegend公司。尼美舒利相對分子質(zhì)量為308.3，購自美國Sigma公司。

1.2實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及藥物準備 于RPMI-1640培養(yǎng)基中接種人肝內(nèi)膽管癌細胞系HCCC-9810，飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)，每2～3 d進行傳代1次。收集對數(shù)生長期細胞進行實驗。取308.3 mg尼美舒利溶于1 mL的二甲亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)中，加入9 mL的培養(yǎng)基配成100 mmol·L-1母液，實驗時用RPMI-1640培養(yǎng)基進行稀釋，將其配成終濃度分別為25、50、100、200 μmol·L-1的尼美舒利備用。采用質(zhì)量分數(shù)0.25%胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的膽管癌細胞,制成細胞密度為1×106·mL-1的單細胞懸液，以每孔2 mL接種于6孔板內(nèi)，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞24 h，設(shè)立實驗組與對照組進行實驗，實驗組加入不同濃度的尼美舒利，對照組不加藥，檢測相關(guān)指標。

1.2.2 細胞因子測定 收集對數(shù)生長期的膽管癌細胞，2 mL每孔接種于6孔板內(nèi)，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞24 h，設(shè)立實驗組與對照組，實驗組中加入不同濃度的尼美舒利繼續(xù)培養(yǎng)，對照組不加藥，每組設(shè)3個復(fù)孔，72 h后分別吸取上清液，用ELISA法分別檢測IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ表達水平。

1.2.3 Th1、Th2亞群流式細胞儀檢測 收集不同濃度尼美舒利處理48 h的膽管癌細胞HCCC-9810，離心后棄上清；細胞用磷酸鹽緩沖液洗漂洗，加入固定液0.5 mL固定20 min，1 500 r·min-1離心5 min，棄上清，加入2 mL穿透液，室溫暗處10 min，1 000 r·min-1離心5 min，加入FITC標記的抗IFN-γ和PE標記的抗IL-4單抗，避光孵育30 min，2 mL穿透液漂洗1次，0.5 mL多聚甲醛懸浮細胞后應(yīng)用流式細胞儀檢測IFN-γ和IL-4水平。

2 結(jié)果

2.1尼美舒利對膽管癌細胞HCCC-9810中Th1、Th2細胞因子分泌的影響尼美舒利作用后，隨其藥物濃度升高，膽管癌細胞HCCC-9810中IL-2、IFN-γ水平升高，而IL-4、IL-6水平下降 (P<0.05)。見表1。

表1 尼美舒利對膽管癌細胞HCCC-9810中Th1、Th2細胞因子分泌的影響 ng·L-1

注：與尼美舒利0 μmol·L-1組比較，1)P<0.05

2.2尼美舒利對膽管癌細胞HCCC-9810中Th1/Th2比值的影響流式細胞儀顯示隨尼美舒利濃度升高，實驗組Th1細胞陽性率升高，而Th2細胞呈下降趨勢，Th1/Th2比值升高(P<0.05)。見表2。

表2 尼美舒利對膽管癌細胞HCCC-9810中Th1/Th2比值的影響

注：與尼美舒利0 μmol·L-1組比較，1)P<0.05

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與荷瘤機體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)，對多種腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織能夠通過分泌Th2細胞因子，改變Th1/Th2平衡以逃避免疫監(jiān)視，Th2細胞優(yōu)勢狀態(tài)是腫瘤細胞存活、發(fā)展的可能機制之一。Yamamura等[4]首先報道腫瘤患者呈Th2細胞因子優(yōu)勢表達，處于Th1/Th2偏移狀態(tài)，這種偏移可能是導(dǎo)致腫瘤細胞產(chǎn)生免疫逃逸持續(xù)增長的機制。Li等[5]采用ELISA法檢測了124例非小細胞肺癌患者和124例健康體檢個體外周血術(shù)前術(shù)后Th1和Th2細胞因子的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)非小細胞肺癌患者術(shù)前IL-4和IL-10水平明顯升高，而IL-2和IFN-γ水平顯著降低。同術(shù)前比較，術(shù)后患者IL-4和IL-10水平顯著降低，而IL-2和IFN-γ水平明顯升高。術(shù)后IL-4水平異常的患者1、3 a累積復(fù)發(fā)率明顯高于正常患者，且中位生存時間和生存率顯著降低。因此進一步研究腫瘤細胞Thl/Th2狀態(tài)可能為腫瘤免疫治療提供新的靶點。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，長期口服非甾體抗炎藥人群罹患腫瘤的發(fā)生減少，體內(nèi)外實驗也顯示非甾體抗炎藥能夠通過抑制COX-2表達抑制多種腫瘤細胞的生長增殖。也有研究[6]發(fā)現(xiàn)COX-2通過催化花生四烯酸使其代謝產(chǎn)物前列腺素E2增加，進一步通過其受體抑制樹突狀細胞的分化和功能,通過Th1/Th2偏移減弱細胞免疫所調(diào)節(jié)的抗腫瘤反應(yīng)，這為膽管癌的防治提供了新的分子靶點。我們前期試驗[7-8]也發(fā)現(xiàn)，選擇性COX-2抑制劑尼美舒利抑制膽管癌細胞的增殖，且呈明顯的劑量與時間依賴性，作用機制可能與誘導(dǎo)膽管癌細胞凋亡有關(guān)。為進一步探討COX-2抑制劑抑制腫瘤生長的作用機制，本研究繼續(xù)采用選擇性COX-2抑制劑尼美舒利作用于膽管癌細胞，觀察其對膽管癌細胞Th1/Th2平衡的影響。我們采用ELISA法和流式細胞儀檢測不同濃度尼美舒利作用于膽管癌細胞后Th1、Th2細胞因子的表達，以進一步探討逆轉(zhuǎn)Th1/Th2狀態(tài)對腫瘤細胞的影響。我們發(fā)現(xiàn)，隨藥物濃度增加，IL-2、IFN-γ水平呈現(xiàn)上升趨勢，而IL-4、IL-6水平下降，Th1/Th2比例升高，這種作用在低水平時就開始出現(xiàn)，并隨著藥物濃度升高而增強，表現(xiàn)為明顯的逆轉(zhuǎn)作用，這提示我們尼美舒利可能是通過誘導(dǎo)膽管癌細胞表達Th1細胞因子而抑制Th2細胞因子的表達，從而逆轉(zhuǎn)Th1/Th2偏移，抑制腫瘤生長。

綜上所述，膽管癌細胞Th2優(yōu)勢表達可能是腫瘤細胞逃避細胞免疫應(yīng)答的機制之一，通過調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，改善機體免疫狀態(tài)，從而實現(xiàn)對腫瘤的免疫治療成為可能。