張自森，王夢(mèng)丹，劉世佳，馬子涵，陳發(fā)帥，巴 楠，夏興洲

(1.鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南 鄭州 450052；2.鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院普通外科，河南 鄭州 450052；3.鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 鄭州 450052)

胃癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居于第2位[1]。E-鈣黏附蛋白(E-cadherin)與胃癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，可通過(guò)調(diào)節(jié)多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路影響胃癌細(xì)胞增殖[2]。本實(shí)驗(yàn)采用慢病毒介導(dǎo)方法抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)，觀察了基因抑制效果和對(duì)5-Fu作用的影響，為進(jìn)一步探討E-cadherin為靶點(diǎn)的胃癌個(gè)體化精準(zhǔn)治療的可行性提供參考。

1 材料與方法

1.1材料與試劑人胃癌細(xì)胞株SGC-7901購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。Annexin V-FICT/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自上海美季生物技術(shù)公司；人E-cadherin單克隆抗體(sc-8008)、人β-actin單克隆抗體(sc-1610R)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；RNA提取試劑盒和cDNA第1鏈合成試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；CDH1-siRNA設(shè)計(jì)合成和GV248慢病毒載體(元件順序：hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin)構(gòu)建由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司完成。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含體積分?jǐn)?shù)10%小牛血清、100 u·mL-1青霉素以及100 μg·mL-1鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)胃癌SGC-7901細(xì)胞，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2、飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2.2 CDH1-siRNA感染細(xì)胞和有效siRNA篩選 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的待感染的胃癌SGC-7901細(xì)胞，消化細(xì)胞計(jì)數(shù)，制成細(xì)胞懸液。感染前1 d將細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種5×105個(gè)細(xì)胞，放于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞密度為80%～90%時(shí)，進(jìn)行感染。加入培養(yǎng)基1 mL/孔，再分別加入稀釋病毒液各100 μL(感染復(fù)數(shù)值相當(dāng)于50)，培養(yǎng)24 h后換液,繼續(xù)培養(yǎng)72～96 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。分別用RT-PCR和Western blot法檢測(cè)E-cadherin mRNA和蛋白的表達(dá)，用最有效的CDH1-siRNA片段用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人胃癌SGC-7901細(xì)胞和CDH1-siRNA穩(wěn)定感染的胃癌SGC-7901細(xì)胞以每孔5×104個(gè)細(xì)胞加入96孔板，每孔200 μL。設(shè)實(shí)驗(yàn)組5-Fu的濃度分別為0.25 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1 mg·L-1、2 mg·L-1、4 mg·L-1，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，每個(gè)濃度隨機(jī)設(shè)置3個(gè)孔。將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)48 h，每孔再加入10 μL的5 g·L-1的噻唑蘭(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄掉培養(yǎng)孔中的上清液，向每孔中加入100 μL二甲基亞砜，低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，于490 nm處，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔的吸光度(A)值，記錄數(shù)值，計(jì)算半抑制濃度(50% inhibitory concentration ，IC50)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，操作過(guò)程中注意避光。抑制率(%)=(對(duì)照組A490 nm-實(shí)驗(yàn)組A490 nm)/對(duì)照組A490 nm×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 2組細(xì)胞藥物處理完畢后，常規(guī)消化，制成細(xì)胞懸液。將約1×106個(gè)細(xì)胞移入離心管中，1 000 r·min-1，離心5 min，棄去上清后，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗1次，在離心管中留約0.5 mL PBS，將細(xì)胞混勻。加入體積分?jǐn)?shù)70%冰乙醇固定，4 ℃放置8 h以上。檢測(cè)時(shí)，離心棄去乙醇，PBS洗1次，在離心管中留0.5 mL PBS，打散細(xì)胞團(tuán)，然后加入5 μL AnnexinV-FITC，4 ℃避光孵育15 min。上機(jī)檢測(cè)前5 min再加入碘化丙錠(PI)5 μL，避光孵育。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.5 RT-PCR檢測(cè)目的基因mRNA的表達(dá) Trizol法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物序列如下：E-cadherin(CDH1)：上游：5’-TGGGCTGGACCGAGAGAGTT-3’，下游：5’-ATCTCCAGCCAGTTGGCAGT-3’； B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/ leukemia-2, Bcl-2)：上游：5’-GTGGAGGAGCTCTTCAGGGA-3’，下游：5’-AGGCACCCAGGGTGATGCAA-3’；Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 related X protein, Bax)：上游：5’-GGCCCACCAGCTCTGAGCAGA-3’，下游：5’-GCCACGTGGGCGTCCCAAAGT-3’；磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase， GAPDH)：上游：5’-ATCCCATCACCATCTTCCAG-3’，下游：5’-CCATCACGCCACAGTTTCC-3’。PCR反應(yīng)條件：反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，循環(huán)35次，72 ℃延伸5 min，4 ℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.6 Western-blot法檢測(cè)E-cadherin蛋白的表達(dá) 取感染組及空白對(duì)照組的細(xì)胞裂解后提取總蛋白。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜，放入脫脂牛奶中封閉1 h，加入一抗，4 ℃過(guò)夜，取膜放入Tris-HCl緩沖鹽溶液中洗3次，每次5 min，加入酶標(biāo)的二抗，室溫孵育2 h，洗膜，加ECL底物顯影。

2 結(jié)果

2.1CDH1-siRNA轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細(xì)胞的效率觀察綠色螢光蛋白(green fluorescent protein，GFP)標(biāo)記的病毒對(duì)照感染胃癌SGC-7901細(xì)胞后，48 h即可見(jiàn)熒光表達(dá)，96 h可見(jiàn)強(qiáng)烈熒光表達(dá)，感染復(fù)數(shù)50時(shí)對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的感染效率較高，表達(dá)效率為81.99%。

2.2CDH1-siRNA對(duì)E-cadherin的抑制作用及最有效靶點(diǎn)的篩選RT-PCR分析的結(jié)果顯示，穩(wěn)定感染不同目的片段慢病毒CDH1-siRNA后，E-cadherin mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。4條CDH1-siRNA中，以CDH1-siRNA3對(duì)E-cadherin mRNA相對(duì)表達(dá)量的抑制最為明顯。Western blot法半定量分析結(jié)果顯示，各組E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。4條CDH1-siRNA中，也以CDH1-siRNA3對(duì)E-cadherin蛋白表達(dá)量的抑制最為明顯。RT-PCR和Western blot結(jié)果均顯示CDH1-siRNA3對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞中E-cadherin的抑制效果最強(qiáng)，選擇其進(jìn)行后續(xù)研究。見(jiàn)表1、圖1～4。

表1 CDH1-siRNA感染后胃癌SGC-7901細(xì)胞E-cadherin mRNA和蛋白的表達(dá)情況

圖1 CDH1-siRNA感染后胃癌SGC-7901細(xì)胞E-cadherin mRNA表達(dá)情況

圖2 CDH1-siRNA感染后胃癌SGC-7901細(xì)胞E-cadherin mRNA表達(dá)電泳圖

圖3 CDH1-siRNA感染后胃癌SGC-7901細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)情況

圖4 CDH1-siRNA感染后胃癌SGC-7901細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)情況

2.3CDH1-siRNA對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞5-Fu生長(zhǎng)抑制的影響MTT法檢測(cè)5-Fu不同藥物濃度0.25 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1 mg·L-1、2 mg·L-1、4 mg·L-1對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為(11.262±0.533)%、(26.244±0.714)%、(48.262±1.533)%、(63.631±1.108)%、(72.262±2.096)%。對(duì)CDH1-siRNA感染后胃癌SGC-7901細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為(8.113±0.296)%、(15.660±0.349)%、(28.262±0.872)%、(43.631±1.207)%、(64.622±1.906)%。CDH1-siRNA感染前后胃癌SGC-7901細(xì)胞對(duì)5-Fu的IC50分別為1.27 mg·L-1和2.35 mg·L-1。CDH1-siRNA感染后胃癌SGC-7901細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性顯著下降。見(jiàn)圖5。

圖5 MTT法檢測(cè)5-Fu對(duì)CDH1-siRNA感染后胃癌SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)抑制情況

2.4CDH1-siRNA對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞5-Fu誘導(dǎo)凋亡的影響5-Fu終濃度為2 mg·L-1作用48 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)照組胃癌SGC-7901細(xì)胞和CDH1-siRNA感染的胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡率分別為69.11%和47.11%。CDH1-siRNA顯著增強(qiáng)了胃癌SGC-7901細(xì)胞抗5-Fu誘導(dǎo)凋亡的能力。見(jiàn)圖6。

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CDH1-siRNA感染后胃癌SGC-7901細(xì)胞5-Fu誘導(dǎo)凋亡情況

2.5CDH1-siRNA對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞中Bcl-2、Bax基因表達(dá)的影響RT-PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax mRNA的相對(duì)表達(dá)情況，結(jié)果顯示，CDH1-siRNA對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的E-cadherin mRNA表達(dá)明顯抑制時(shí)，Bcl-2 mRNA表達(dá)增高，Bax mRNA表達(dá)下降。當(dāng)用5-Fu誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)，2組細(xì)胞中Bcl-2 mRNA表達(dá)增高，Bax mRNA表達(dá)下降。見(jiàn)表2、圖7。

3 討論

E-cadherin是細(xì)胞間的關(guān)鍵黏附分子之一，與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。E-cadherin功能喪失在腫瘤發(fā)展過(guò)程中是一種常見(jiàn)現(xiàn)象，也是一個(gè)關(guān)鍵步驟，其表達(dá)缺失致細(xì)胞間接觸抑制喪失，細(xì)胞侵襲能力增加，腫瘤進(jìn)展[3-4]。E-cadherin也是胃癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵基因，能調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力，是多種分子機(jī)制調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞增殖的共同效應(yīng)靶點(diǎn)[5-6]。E-cadherin表達(dá)抑制可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡和降低細(xì)胞化療敏感性[7-8]。E-cadherin表達(dá)下調(diào)不僅影響順鉑敏感性，在多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)其表達(dá)抑制與細(xì)胞對(duì)5-Fu作用的敏感性下降有關(guān)[9-10]。

5-Fu是胃癌化療方案中最基礎(chǔ)也是最常用的藥物，了解E-cadherin表達(dá)改變對(duì)胃癌細(xì)胞5-Fu作用敏感性的關(guān)系對(duì)晚期胃癌患者的個(gè)體化精準(zhǔn)治療方案選擇具有重要意義。慢病毒介導(dǎo)的基因干擾可能成為臨床基因治療的新方法[11]，本研究構(gòu)建了4條針對(duì)E-cadherin基因的小分子RNA，通過(guò)慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細(xì)胞，結(jié)果表明均能有效抑制E-cadherin基因和蛋白表達(dá)。進(jìn)一步研究顯示，E-cadherin表達(dá)下調(diào)降低了胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖能力，需增加5-Fu的藥物濃度才能夠達(dá)到對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制。陳勇等[12]研究也發(fā)現(xiàn)，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)，可顯著降低其對(duì)順鉑、5-Fu等化療藥物的敏感性。

表2 5-Fu作用前后胃癌SCG-7901細(xì)胞中Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)情況

圖7 5-Fu作用前后胃癌SCG-7901細(xì)胞中Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)情況

凋亡是化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的主要模式，許多凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)變化影響了腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。5-Fu有明顯的誘導(dǎo)胃腫瘤細(xì)胞分化與凋亡作用[13]。本研究結(jié)果表明，E-cadherin表達(dá)抑制后降低了胃癌SGC-7901細(xì)胞對(duì)5-Fu誘導(dǎo)凋亡的作用，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。體外研究發(fā)現(xiàn)，Bax的表達(dá)激活與5-Fu作用敏感性關(guān)系密切，在多種類型腫瘤細(xì)胞中可增強(qiáng)5-Fu敏感性[14-16]。在臨床研究中也發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中Bax表達(dá)檢測(cè)有助于化療方案選擇，其表達(dá)與FOLFOX方案化療效果相關(guān)[17]。

本研究中發(fā)現(xiàn)5-Fu化療誘導(dǎo)凋亡和E-cadherin表達(dá)抑制均可導(dǎo)致Bcl-2的表達(dá)上調(diào)，這種上調(diào)在2種因素同時(shí)作用時(shí)并未表現(xiàn)為疊加現(xiàn)象，可能與E-cadherin抑制后Bcl-2相對(duì)表達(dá)量處于低水平有關(guān)。5-Fu化療誘導(dǎo)凋亡和E-cadherin表達(dá)抑制均可導(dǎo)致Bax的表達(dá)下調(diào)，這種下調(diào)在2種因素同時(shí)存在時(shí)缺表現(xiàn)為疊加。這些結(jié)果提示，E-cadherin表達(dá)抑制所導(dǎo)致的胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡機(jī)制甚為復(fù)雜，可能還存在著其他信號(hào)傳導(dǎo)分子的共同參與。Bcl-2的表達(dá)能夠使E-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞間的黏附性下降，促使細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[18]。本研究中E-cadherin表達(dá)抑制時(shí)Bcl-2的表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明E-cadherin表達(dá)下調(diào)和BCL-2的表達(dá)上調(diào)共同參與了細(xì)胞表型惡性轉(zhuǎn)化。

綜上所述，慢病毒介導(dǎo)的E-cadherin基因干擾能有效抑制E-cadherin在胃癌SGC-7901細(xì)胞中的表達(dá)，并降低細(xì)胞對(duì)5-Fu作用的敏感性，為E-cadherin為靶標(biāo)的臨床轉(zhuǎn)化研究提供了參考。