羅 靜，趙紅宇，徐煒楨，楊國(guó)華，岳 鵬，張 良,*

（1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，食品生物技術(shù)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610039；2.四川省丹丹郫縣豆瓣集團(tuán)股份有限公司國(guó)家企業(yè)技術(shù)中心，四川省豆瓣釀制技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，食品用酶生物發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，四川 成都 611732）

郫縣豆瓣屬中國(guó)傳統(tǒng)地方特色發(fā)酵食品，迄今為止已有300多年的歷史，被列為中國(guó)非物質(zhì)文化遺產(chǎn)。郫縣豆瓣不僅生產(chǎn)工藝獨(dú)特，也以其味辣香醇、黏稠絨實(shí)、紅棕油亮、醬香濃郁等特點(diǎn)在我國(guó)醬類產(chǎn)品中獨(dú)樹一幟，堪稱川菜之魂[1-2]。截止2015年末，郫縣豆瓣品牌價(jià)值已達(dá)607.16億 元，位列“加工食品類地理標(biāo)志產(chǎn)品”全國(guó)第一；當(dāng)年產(chǎn)品總產(chǎn)量達(dá)到110萬(wàn) t，實(shí)現(xiàn)工業(yè)產(chǎn)值102億 元，出口世界絕大部分國(guó)家和地區(qū)，創(chuàng)匯超過(guò)4 000萬(wàn) 美元[3]。

郫縣豆瓣的生產(chǎn)包括前期發(fā)酵和后熟發(fā)酵2 個(gè)階段，前期發(fā)酵主要是指蠶豆霉瓣子的制曲和辣椒坯的預(yù)處理[2]。后熟發(fā)酵主要是將成熟霉瓣子和成熟辣椒坯按比例配料混合，加入適量食鹽和水，進(jìn)入發(fā)酵池發(fā)酵，經(jīng)過(guò)一定時(shí)期的翻曬和陳化，即是郫縣豆瓣特有的日曬夜露工藝[4-5]。因此，將郫縣豆瓣的生產(chǎn)過(guò)程表述為：以蠶豆瓣制曲、辣椒坯和環(huán)境微生物等復(fù)雜的物質(zhì)能量代謝過(guò)程為前提，通過(guò)獨(dú)特的“日曬夜露”開發(fā)發(fā)酵工藝，使得棲息在曲藥、辣椒坯、環(huán)境中的龐大微生物區(qū)系在發(fā)酵醅固、液、氣三相界面發(fā)生復(fù)雜的物質(zhì)轉(zhuǎn)換、能量代謝和信息傳遞作用，并最終形成郫縣豆瓣獨(dú)特的成分構(gòu)成和風(fēng)味特征。

郫縣豆瓣以其醬香濃郁、味辣香醇等特點(diǎn)而聞名于世，其獨(dú)特的風(fēng)味主要來(lái)源于發(fā)酵過(guò)程中微生物相對(duì)封閉的混合發(fā)酵過(guò)程所產(chǎn)生的各種呈香物質(zhì)[5]。目前，國(guó)內(nèi)已有眾多學(xué)者對(duì)郫縣豆瓣中揮發(fā)性呈香物質(zhì)進(jìn)行研究，如使用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace solid phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯(lián)用[6]、同時(shí)蒸餾萃取結(jié)合GC-MS[7-8]、GC-MS聯(lián)用[9-10]、電子鼻[11]等技術(shù)手段對(duì)郫縣豆瓣中呈香物質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè)。

本研究通過(guò)HS-SPME-GC-MS對(duì)不同后發(fā)酵時(shí)期的郫縣豆瓣中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析鑒定，使用SPSS軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及主成分分析。旨在研究郫縣豆瓣在不同后發(fā)酵時(shí)期主要風(fēng)味物質(zhì)的種類及變化過(guò)程，以期為進(jìn)一步加深對(duì)本土特色調(diào)味品發(fā)酵機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)代化改造和食品質(zhì)量安全控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

郫縣豆瓣樣品取自四川省丹丹郫縣豆瓣集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)車間。分別采取已進(jìn)行后發(fā)酵6 個(gè)月，1、2、3 a及5 a的豆瓣（分別編號(hào)為6M、1Y、2Y、3Y及5Y）。由于郫縣豆瓣在后發(fā)酵時(shí)，隔段時(shí)間需進(jìn)行攪拌、翻曬，故取樣時(shí)從每個(gè)發(fā)酵池的上層（距表面0～20 cm）、中層（距表面30～50 cm）、下層（距池底0～20 cm）各取25 g左右，混勻后密封，低溫運(yùn)輸，于-70 ℃保存?zhèn)溆谩槊庹`差，呈香物質(zhì)分析需在2 d內(nèi)完成。

1.2 儀器與設(shè)備

SPME裝置 美國(guó)Supelco公司；QP2010plus GC-MS聯(lián)用儀 日本島津公司；CU-420恒溫循環(huán)槽 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；90 mm研缽 唐山市開平盛興化學(xué)瓷廠。

1.3 方法

1.3.1 基于HS-SPME法的郫縣豆瓣后發(fā)酵期揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)提取

稱取5.0 g研磨后的樣品，放入15 mL密封頂空瓶中，置于55 ℃恒溫水浴循環(huán)槽中平衡20 min。然后將老化后的75 μm碳分子篩/聚二甲基硅氧烷萃取頭插入頂空瓶中吸附30 min，隨后再插入GC進(jìn)樣口，250 ℃解吸5 min。

1.3.2 GC-MS分析

GC條件：DB-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為氦氣，流速1 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；不分流進(jìn)樣；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持2 min，再以3 ℃/min升至160 ℃，隨后以6 ℃/min升至200 ℃，保留3 min，最后以10 ℃/min升至230 ℃，保持3 min。

MS條件：電子電離源；離子源溫度230 ℃；接口溫度280 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 40～600；溶劑延遲時(shí)間2 min；掃描模式為全掃描。

揮發(fā)性物質(zhì)的定性：主要采取譜庫(kù)檢索和保留指數(shù)2 種方法進(jìn)行郫縣豆瓣樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的定性。譜庫(kù)檢索：主要依據(jù)所檢測(cè)出物質(zhì)的質(zhì)譜信息與NIST 11譜庫(kù)進(jìn)行比較，根據(jù)相似度的高低進(jìn)行取舍，一般大于80%時(shí)對(duì)該物質(zhì)予以確認(rèn)。保留指數(shù)鑒定：以C8～C20的正構(gòu)烷烴為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的保留指數(shù)，與其他文獻(xiàn)中相同物質(zhì)的保留指數(shù)進(jìn)行比較予以確認(rèn)。

每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，取其平均值進(jìn)行后續(xù)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用峰面積歸一化法算出各成分的峰面積，各成分峰面積與所有成分總峰面積的比值作為該成分的相對(duì)含量。采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同后發(fā)酵時(shí)期郫縣豆瓣樣品中揮發(fā)性呈香物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

如圖1所示，共檢測(cè)出超過(guò)140 種揮發(fā)性物質(zhì)，相較于以往采用同時(shí)蒸餾萃取結(jié)合GC-MS聯(lián)用（56[7]、86 種和78 種[10]）和SPME-GC-MS（81 種）[6]更多，這說(shuō)明郫縣豆瓣后發(fā)酵期的揮發(fā)性呈香物質(zhì)組成和演替變化過(guò)程非常復(fù)雜，值得進(jìn)一步分析研究。從圖1可以看出，不同后發(fā)酵期的郫縣豆瓣揮發(fā)性呈香物質(zhì)組成差異不大（86%的物質(zhì)保留時(shí)間重合），但呈香物質(zhì)含量具有一定差異。同時(shí)，后發(fā)酵期3Y和5Y的郫縣豆瓣相較6M、1Y和2Y的各物質(zhì)峰分布則更為均衡，其呈香物質(zhì)綜合構(gòu)成更為復(fù)雜。

圖1 郫縣豆瓣樣品中揮發(fā)性成分總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of volatile components in 5 PDB samples

表1 不同后發(fā)酵期郫縣豆瓣中揮發(fā)性物質(zhì)Table 1 Volatile components identified in 5 PDB samples

續(xù)表1

續(xù)表1

由表1可知，不同后發(fā)酵時(shí)期至少存在于2 種郫縣豆瓣樣品中，且相對(duì)含量不小于1%的揮發(fā)性物質(zhì)，合計(jì)80 種?？傮w，隨著后發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，郫縣豆瓣中揮發(fā)性呈香物質(zhì)種類越來(lái)越多，后發(fā)酵3 a的樣品可達(dá)到72 種。

后發(fā)酵6 個(gè)月的郫縣豆瓣中共檢測(cè)出68 種可分析揮發(fā)性呈香物質(zhì)，相對(duì)含量最高的3 類物質(zhì)分別為醇類14 種（41.79%）、酚類3 種（18.80%）、酯類14 種（18.09%），共計(jì)78.68%。其中主要成分包括乙醇（20.11%）、4-乙基愈創(chuàng)木酚（16.61%）、乙酸乙酯（11.53%）、苯乙醇（10.34%）以及糠醇（4.44%），前5 種物質(zhì)相對(duì)含量之和為63.03%。

后發(fā)酵1 a的郫縣豆瓣中共檢測(cè)出68 種，相對(duì)含量最高的分別為酯類15 種（37.13%）、醇類12 種（23.66%）、醛類15 種（13.53%），共計(jì)74.32%。主要成分包括乙酸乙酯（31.57%）、4-乙基愈創(chuàng)木酚（10.05%）、乙醇（6.38%）、苯乙醇（6.07%）以及苯乙醛（5.10%），相對(duì)含量之和為59.17%。

后發(fā)酵2 a的郫縣豆瓣樣品中共檢測(cè)出71 種揮發(fā)性物質(zhì)，相對(duì)含量最高的分別為醇類14 種（25.11%）、酚類3 種（20.39%）、酯類15 種（17.97%），共計(jì)63.47%。具體包括4-乙基愈創(chuàng)木酚（16.47%）、乙酸乙酯（15.23%）、苯乙醇（10.18%）、苯乙醛（5.87%）、乙醇（4.64%），相對(duì)含量之和為52.39%。

后發(fā)酵3 a的郫縣豆瓣中共檢測(cè)出72 種揮發(fā)性物質(zhì)，相對(duì)含量最高的分別為醛類17 種（24.90%）、酯類14 種（24.06%）、醇類14 種（18.54%），共計(jì)67.50%。具體包括乙酸乙酯（16.10%）、苯乙醛（8.40%）、苯乙醇（6.01%）、4-乙基愈創(chuàng)木酚（5.11%）、十三酸乙酯（4.88%），相對(duì)含量之和為40.50%。

后發(fā)酵5 a的郫縣豆瓣中共檢測(cè)出70 種揮發(fā)性物質(zhì)，相對(duì)含量最高的分別為醛類18 種（26.37%）、酯類13 種（22.08%）、醇類13 種（17.57%），共計(jì)66.02%。具體包括乙酸乙酯（17.51%）、苯乙醛（9.60%）、苯乙醇（5.60%）、4-乙基愈創(chuàng)木酚（4.68%）、2-乙?；量?.57%），相對(duì)含量之和為40.96%。

2.2 不同后發(fā)酵期郫縣豆瓣5 種主體揮發(fā)性成分情況分析

圖2 郫縣豆瓣中的揮發(fā)性物質(zhì)總相對(duì)含量與排名前5 種物質(zhì)的比例Fig. 2 Relative contents of total volatile components and percentages of top 5 dominant components in 5 PDB samples

為進(jìn)一步明確郫縣豆瓣中的主要揮發(fā)性物質(zhì)，將總相對(duì)含量與排名前5的物質(zhì)單獨(dú)剝離出來(lái)分析，如圖2所示。5 種主體揮發(fā)性呈香物質(zhì)的相對(duì)含量是隨著郫縣豆瓣后發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而遞減的，即是后發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)的郫縣豆瓣，單純依靠譜庫(kù)檢索及保留指數(shù)分析揮發(fā)性物質(zhì)峰面積占比總和越來(lái)越小，不能準(zhǔn)確定性的比例則越來(lái)越大。究其原因可能是，隨著后發(fā)酵的進(jìn)行，郫縣豆瓣發(fā)酵體系中半開放的微生物區(qū)系不斷發(fā)生復(fù)雜的鏈?zhǔn)缴x反應(yīng)，前期的代謝產(chǎn)物成為后期代謝反應(yīng)的前體物質(zhì)，如此循環(huán)往復(fù)，導(dǎo)致最后出現(xiàn)了不常見的、NIST譜庫(kù)中沒(méi)有收錄的揮發(fā)性物質(zhì)。

此外，3 a與5 a后發(fā)酵期的郫縣豆瓣相比其他具有最大的相似性。6 個(gè)月中相對(duì)含量前5的揮發(fā)性物質(zhì)峰面積總和為63.03%，占所有可分析物質(zhì)峰面積總和的67.38%，隨著后發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，其占比分別為64.26%、61.35%、47.99%、49.42%，總體來(lái)看也呈現(xiàn)遞減的趨勢(shì)。這說(shuō)明，后發(fā)酵時(shí)間更長(zhǎng)的郫縣豆瓣呈香物質(zhì)的相對(duì)含量分布更為均衡，組分綜合組成也更復(fù)雜。揮發(fā)性呈香物質(zhì)的總量下降最大的時(shí)期是后發(fā)酵1～2 a階段，相對(duì)含量前5的揮發(fā)性物質(zhì)峰面積百分比之和下降最大的時(shí)期是后發(fā)酵2～3 a階段，這2 個(gè)階段可能是郫縣豆瓣后發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性呈香物質(zhì)發(fā)生關(guān)鍵變化的重要階段。

2.3 不同后發(fā)酵期郫縣豆瓣揮發(fā)性呈香物質(zhì)演替情況分析

醇類是構(gòu)成郫縣豆瓣特征風(fēng)味的一類重要化合物，通常呈現(xiàn)出令人愉快的香味及甜味，可以被氧化成醛類、酸類等，還是酯化反應(yīng)的重要前體物質(zhì)[12-13]。從表1可以看出，隨著后發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，醇類物質(zhì)相對(duì)含量逐漸下降，這可能是郫縣豆瓣后發(fā)酵過(guò)程中不斷發(fā)生醇的氧化反應(yīng)、酸與醇的酯化反應(yīng)等。后發(fā)酵初期時(shí)（后發(fā)酵6 個(gè)月至2 a），由于發(fā)酵體系中營(yíng)養(yǎng)豐富和特殊的“日曬夜露、翻池?cái)嚢琛卑l(fā)酵工藝，整個(gè)體系處于活躍的代謝狀態(tài)。醇類的合成與消耗處于非平衡狀態(tài)，代謝反應(yīng)與合成反應(yīng)先后分別占優(yōu)勢(shì)，因而醇類物質(zhì)相對(duì)含量呈現(xiàn)出急劇降低后又升高的波動(dòng)；后發(fā)酵3 a后，發(fā)酵微生物趨于穩(wěn)定，醇類的合成與消耗基本保持平衡態(tài)，因而后發(fā)酵3 a樣品與5 a樣品的醇類物質(zhì)相對(duì)含量幾乎相等。從表1可以看出，乙醇和苯乙醇是相對(duì)含量最高的2 種醇類物質(zhì)，有研究表明這2 種醇類物質(zhì)也大量存在于醬油中[14]。

醛酮類通常呈現(xiàn)出令人滿意的甜香及花果香，較多存在于糖果、水果及堅(jiān)果中，被認(rèn)為可以增強(qiáng)食品的風(fēng)味品質(zhì)[15]。郫縣豆瓣樣品中醛酮類物質(zhì)的相對(duì)含量隨著后發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加。由于醛酮類主要由醇類氧化產(chǎn)生，其相對(duì)含量變化趨勢(shì)與醇類呈負(fù)相關(guān)；醛酮類大多屬于不穩(wěn)定的化合反應(yīng)中間體，容易被還原為醇[16]。但其卻在3Y及5Y樣品中大量存在，這從側(cè)面印證了郫縣豆瓣經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵之后，其內(nèi)部微生物呈現(xiàn)“衰弱態(tài)”，新陳代謝反應(yīng)趨于平緩，累積了大量的醛酮類反應(yīng)中間體。

苯甲醛和苯乙醛是相對(duì)含量最高的2 種醛類物質(zhì)，這2 種醛類物質(zhì)同時(shí)也被發(fā)現(xiàn)存在于其他的豆類發(fā)酵食品中[17-19]；3-羥基-2-丁酮是郫縣豆瓣樣品中相對(duì)含量最高的酮類物質(zhì)，有研究表明其是微生物生成吡嗪類物質(zhì)的重要前體化合物[20]。

酯類主要由醇類與酸類的酯化反應(yīng)生成，酯類通常呈現(xiàn)出令人愉悅的甜香及果香，除此之外，酯類還可掩蓋游離脂肪酸帶來(lái)的不愉快氣味[21]。有研究表明，短鏈酯類通常具有較低的閾值（小于相應(yīng)醇類近10 倍）且在常溫條件下即可大量揮發(fā)，從而即使在濃度很低的條件下也能對(duì)食品的風(fēng)味產(chǎn)生較大的影響[22-23]。郫縣豆瓣中的酯類物質(zhì)相對(duì)含量，由6M中的18.09%上升至1Y中的37.13%，后又降至2Y樣品中的17.97%，最后再緩慢地上升。究其原因，可能是6M樣品的風(fēng)味仍然主要由原輔料所具有的天然氣味所構(gòu)成；1Y樣品則因大量合成的酯類而具有濃郁的風(fēng)味特征；2Y樣品，其酯香明顯銳減，但仍是產(chǎn)品風(fēng)味的重要組成部分；對(duì)于3Y及5Y樣品，相比于2Y樣品酯香穩(wěn)定增強(qiáng)，表現(xiàn)出醇厚感。酯類相對(duì)含量的變化而導(dǎo)致的風(fēng)味變化幾乎與郫縣豆瓣后發(fā)酵過(guò)程中感官變化相符。由表1可以看出，乙酸乙酯和十三酸乙酯是郫縣豆瓣中相對(duì)含量最高的2 種酯類，前者呈現(xiàn)出清香、果香及酒香；后者則因其風(fēng)味閾值較高（大分子脂肪酸酯類）而提供風(fēng)味上的厚重感[8]。

郫縣豆瓣中存在的3 種酚類物質(zhì)為愈創(chuàng)木酚、2-乙基苯酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚，其中4-乙基愈創(chuàng)木酚相對(duì)含量最高，占豆瓣樣品中酚類物質(zhì)的80%以上（6M及1Y樣品中達(dá)到90%）。酚類由于其易氧化的性質(zhì)，在后發(fā)酵過(guò)程中會(huì)不斷被消耗，其相對(duì)含量應(yīng)不斷減少。從表1可看出這一趨勢(shì)，總體上隨著后發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酚類物質(zhì)的相對(duì)含量逐漸下降，但在后發(fā)酵2 a時(shí)出現(xiàn)波動(dòng)，2Y樣品具有相對(duì)含量最高的酚類物質(zhì)，可能與后發(fā)酵前期時(shí)活躍的微生物新陳代謝反應(yīng)有關(guān)。有研究表明，4-乙基愈創(chuàng)木酚呈現(xiàn)出醬香、辛香的風(fēng)味[24]。郫縣豆瓣后發(fā)酵前期（2 a前）具有較高相對(duì)含量的4-乙基愈創(chuàng)木酚（10%以上），到后期（3 a以后）則銳減至5%左右；這也與實(shí)際生產(chǎn)中，“老”豆瓣醬香醇厚綿長(zhǎng)而新豆瓣醬香濃郁突出的情況相符。烴類物質(zhì)由于相對(duì)含量極低，而風(fēng)味閾值較高，對(duì)郫縣豆瓣的風(fēng)味貢獻(xiàn)較小，在此處不進(jìn)行詳細(xì)討論。

郫縣豆瓣后發(fā)酵期的雜環(huán)類物質(zhì)，主要是呋喃、吡嗪和吡咯。雜環(huán)類物質(zhì)主要在后發(fā)酵過(guò)程中由Maillard反應(yīng)和Strecker降解產(chǎn)生的氨基酮經(jīng)縮合反應(yīng)生成，這類物質(zhì)在郫縣豆瓣中相對(duì)含量較低，但具有較低的風(fēng)味閾值[21,25-26]。雜環(huán)類物質(zhì)頻繁出現(xiàn)于各類白酒的研究報(bào)道中，被認(rèn)為對(duì)白酒的特征風(fēng)味具有突出的貢獻(xiàn)[27-28]。由表1可看出，隨著后發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，雜環(huán)類相對(duì)含量不斷上升；其中2-乙?；量┘?,6-二甲基吡嗪是郫縣豆瓣中相對(duì)含量最高的2 種雜環(huán)類物質(zhì)。

酸類主要由醇類氧化產(chǎn)生，通常因其特有的酸性氣味而對(duì)整體風(fēng)味產(chǎn)生不利影響，但其閾值較高，對(duì)豆瓣總體的風(fēng)味貢獻(xiàn)不大[24]。由表1可以看出，隨著后發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，郫縣豆瓣樣品中酸類物質(zhì)相對(duì)含量呈現(xiàn)升降反復(fù)的波動(dòng)狀態(tài)。1Y樣品中酸類物質(zhì)相對(duì)含量最高，達(dá)到1.80%，是2Y和5Y樣品的2倍多，可能是因?yàn)楹蟀l(fā)酵初期微生物生化代謝反應(yīng)活躍，生成了大量初級(jí)代謝產(chǎn)物乙酸；也可能是因?yàn)樵诓煌竟?jié)進(jìn)行后發(fā)酵而導(dǎo)致的差異性。

2.4 主成分分析結(jié)果

利用SPSS 19.0軟件對(duì)5 個(gè)不同后發(fā)酵時(shí)期郫縣豆瓣中揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量進(jìn)行主成分分析，得到主成分相關(guān)矩陣的特征值、方差貢獻(xiàn)率及累計(jì)貢獻(xiàn)率如表2所示。

表2 4 個(gè)主成分的特征值及貢獻(xiàn)率Table 2 Eigenvalues and cumulative contribution rates of 4 principal components

按照主成分分析理論，當(dāng)前r 個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到85%的要求時(shí)，這r 個(gè)主成分即可反映原指標(biāo)中足夠多的信息[29]。由表2可知，主成分1貢獻(xiàn)率為47.409%，主成分2貢獻(xiàn)率為23.905%，主成分3的貢獻(xiàn)率為16.199%，三者累計(jì)貢獻(xiàn)率為87.513%，說(shuō)明此3 個(gè)主成分已包含絕大多數(shù)樣本信息量，故依據(jù)其貢獻(xiàn)率大小依次編號(hào)為第1、2、3主成分。由于三維構(gòu)圖不易觀察樣品分布情況，故只取第1、2主成分生成樣品的主成分得分圖，如圖3所示。

圖3 郫縣豆瓣樣品的主成分得分圖Fig. 3 PCA score plot of PC1 vs. PC2 for 5 PDB samples

由圖3可看出，本研究將5 個(gè)后發(fā)酵階段的郫縣豆瓣顯著區(qū)分成4 類，即是6M、1Y及2Y各自單獨(dú)成1 類，3Y與5Y聚成1 類。本研究雖然沒(méi)有將不同后發(fā)酵時(shí)間作為變量代入主成分構(gòu)圖中，但可以明顯看出，郫縣豆瓣的后發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短在第1主成分上得到了體現(xiàn)，說(shuō)明第1主成分與后發(fā)酵時(shí)間這一變量有一定的相關(guān)性。

對(duì)第1主成分貢獻(xiàn)率較大的呈香物質(zhì)有4 種醇類（乙醇、2-甲基-1-丁醇、糠醇、月桂烯醇）、10 種醛類（乙醛、異戊醛、5-甲基呋喃醛、苯甲醛、苯乙醛等）、5 種酯類（乙酸乙酯、乳酸乙酯、苯乙酸乙酯等）、1 種酸類（異丁酸）、2 種雜環(huán)類（2,5-二甲基呋喃、2-乙?；量┮约? 種烴類物質(zhì)（十五烷等）。因此第1主成分可以歸結(jié)為“醇類、醛類、酯類影響因子”，其中2-甲基-1-丁醇、月桂烯醇、2-乙酰基吡咯、十五烷、十六烷、乙醛、異戊醛、2-甲基丁醛、3-甲基-2-丁烯醛、5-甲基呋喃醛、苯甲醛、苯乙醛及5-甲基-2-苯基-2-己烯醛的相對(duì)含量都隨樣品后發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；而乙醇、糠醇、3-羥基-2-丁酮、苯乙酸乙酯以及紅沒(méi)藥烯的相對(duì)含量都呈相反的變化趨勢(shì)。

在第2主成分上，5 個(gè)發(fā)酵階段呈現(xiàn)出上下波動(dòng)但波動(dòng)幅度逐漸變小的趨勢(shì)。說(shuō)明隨著后發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，郫縣豆瓣中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成及含量逐漸趨于平穩(wěn)。同時(shí)還可以看出，郫縣豆瓣中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)隨時(shí)間變化而發(fā)生的邊際變化越來(lái)越小，在郫縣豆瓣后發(fā)酵的前2 a中，其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成及含量發(fā)生了較大的變化；而當(dāng)后發(fā)酵進(jìn)行到2 a后，郫縣豆瓣的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化速度開始放緩；當(dāng)后發(fā)酵進(jìn)行到3 a后，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化速度尤其緩慢，遠(yuǎn)低于之前的變化速度。

對(duì)第2主成分貢獻(xiàn)率較大的呈香物質(zhì)為正庚醇、異丁醛、乙酸乙酯、丙酸、丁酸、己酸，其中有一半（3 種）都是酸類物質(zhì)，因此第2主成分可以歸結(jié)為“酸類影響因子”。其中，乙酸乙酯、己酸的相對(duì)含量都隨樣品后發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而升高；丙酸呈現(xiàn)隨樣品后發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而降低的趨勢(shì)；正庚醇、異丁醛、丁酸則沒(méi)有明顯的變化規(guī)律。值得注意的是，與上面列出的6 種物質(zhì)相比，對(duì)第1主成分貢獻(xiàn)率較大的26 種呈香物質(zhì)中有18 種（占70%）都呈現(xiàn)出相對(duì)含量隨后發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而升高或下降的趨勢(shì)，從而進(jìn)一步印證了第1主成分與后發(fā)酵時(shí)間這一變量有一定的相關(guān)性。

劉平等[8]發(fā)現(xiàn)糠醛、異戊醛等一級(jí)傳統(tǒng)郫縣豆瓣中的特征香氣物質(zhì)，也是本研究的第1主成分貢獻(xiàn)因子相一致。但是，也有學(xué)者認(rèn)為棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯、油酸乙酯、4-乙基苯酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚及苯乙醇才是構(gòu)成郫縣豆瓣的特殊香味貢獻(xiàn)最大的組分[9]。本研究認(rèn)為，郫縣豆瓣的特色香味是多種芳香物質(zhì)相乘作用賦予的，因此還需要對(duì)不同發(fā)酵階段郫縣豆瓣的揮發(fā)性呈香物質(zhì)進(jìn)行連續(xù)追蹤和大量分析，與此同時(shí)還要建立菌落演替情況與呈香物質(zhì)的聯(lián)系關(guān)系[30]，才能獲得“真正揭示”各組分的貢獻(xiàn)及其變化情況和形成規(guī)律。

3 結(jié) 論

使用HS-SPME-GC-MS分析了5 個(gè)不同后發(fā)酵時(shí)間的郫縣豆瓣中揮發(fā)性呈香物質(zhì)。最終共檢測(cè)出超過(guò)140 種揮發(fā)性呈香物質(zhì)，其中有80 種至少存在于2 個(gè)樣品中且相對(duì)含量不小于1%。

檢測(cè)出的揮發(fā)性呈香物質(zhì)主要分為醇類、醛類、酯類、酸類、酚類、酮類、雜環(huán)類及烴類。隨著樣品后發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，醛類、酯類、烴類及雜環(huán)類物質(zhì)的相對(duì)含量呈上升趨勢(shì)；而醇類、酚類及酮類呈下降趨勢(shì)；酸類則沒(méi)有明顯的變化趨勢(shì)。

無(wú)論是可鑒定呈香物質(zhì)的總量還是呈香物質(zhì)集中度以及呈香物質(zhì)種類構(gòu)成方面，初熟期郫縣豆瓣（后發(fā)酵半年至2 a）和老熟期郫縣豆瓣（后發(fā)酵3 a以后）之間都有較大的差異。初熟期的可鑒定呈香物質(zhì)的總量以及相對(duì)含量前5的呈香物質(zhì)所占比例都隨著后發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，而對(duì)于老熟期（即3Y和5Y），這2 個(gè)指標(biāo)則沒(méi)有明顯變化；在呈香物質(zhì)種類構(gòu)成方面，初熟期間差異較大，各類呈香物質(zhì)有明顯的變化演替過(guò)程，而3Y和5Y沒(méi)有顯著差異。

以揮發(fā)性呈香物質(zhì)相對(duì)含量作為變量進(jìn)行主成分分析，5 個(gè)后發(fā)酵階段的郫縣豆瓣在基于第1主成分和第2主成分的得分圖上得到了較好區(qū)分。6M、1Y及2Y 3 個(gè)樣品各自單獨(dú)成1 類，3Y與5Y樣品聚成1 類。揮發(fā)性呈香物質(zhì)在初熟期間的變化程度遠(yuǎn)大于其在老熟期間的變化程度。同時(shí)，第1主成分可以歸結(jié)為“醇類、醛類、酯類影響因子”，“后發(fā)酵時(shí)間”這一變量與第1主成分有一定相關(guān)性；第2主成分可以歸結(jié)為“酸類影響因子”。

郫縣豆瓣行業(yè)內(nèi)一直有“豆瓣越‘老’越香”的說(shuō)法，各生產(chǎn)廠家都保存有后發(fā)酵時(shí)間持續(xù)3、5 a，甚至更長(zhǎng)的豆瓣酵池。但根據(jù)本研究結(jié)果來(lái)看，當(dāng)處于后發(fā)酵3 a后，其揮發(fā)性呈香物質(zhì)的種類及含量變化都趨于緩慢，再繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵，揮發(fā)性呈香物質(zhì)也不會(huì)產(chǎn)生明顯的變化。或許可以為郫縣豆瓣生產(chǎn)企業(yè)改良生產(chǎn)方式、提高企業(yè)效益提供一定的借鑒意義。